摘要：本研究为了检测庆大霉素在动物组织中的残留，制备了单克隆抗体(Mab)，并建立了敏感的间接竞争化学发光酶免疫分析法(icCLEIA)。首先将庆大霉素与牛血清白蛋白结合作为免疫原，免疫BALB/c小鼠。然后采用杂交瘤技术制备抗庆大霉素单抗。最后，建立了对庆大霉素具有50%抑制浓度(IC₅₀)为0.067 ng/mL的icCLEIA。icCLEIA的检测限为0.002 ng/mL。单抗与结构类似物的交叉反应性<0.01%。庆大霉素在猪肉和鱼类样品中的加样回收率为80 ~ 101%，变异系数<6.4%。样品采用UPLC-MS/MS检测，以评估icCLEIA的可靠性。结果表明，制备的抗庆大霉素单抗可用于动物组织中庆大霉素残留的快速、便捷的免疫检测。

【内容介绍】

1、抗原的制备

采用碳二亚胺偶联法合成法，将载体蛋白(BSA或OVA) 10 mg溶解于2ml PBS (0.01 M, pH 7.4)中，然后加入EDC (6 mg)和NHS (10 mg)，在25°C下温和搅拌0.5 h，然后将溶解于1ml PBS中的庆大霉素(10 mg)滴入上述溶液中。在25℃下搅拌3小时，在0.01 M PBS (pH 7.4)下透析3天。然后将溶液分装并储存在－20℃;采用BSA -庆大霉素偶联物免疫，OVA -庆大霉素包被抗原。最后，用金免疫层析法(GICA)对两种偶联物进行表征，以确定庆大霉素是否成功偶联到BSA和OVA载体蛋白上。

2、庆大霉素单克隆抗体的制备

第一次免疫时，在FCA中乳化BSA -庆大霉素，7只8周龄BALB/c雌性小鼠(每只小鼠)皮下多点免疫，剂量为150µg。4周后，每3周给小鼠注射50µg乳化液中的BSA -庆大霉素，直至第5次免疫。第三次强化免疫7天后，从小鼠尾部抽血获得抗血清。通过间接ELISA检测抗血清的抗体滴度，并通过间接竞争性ELISA检测抗体选择性。第四次免疫后，选择血清稀释度高且对庆大霉素检测灵敏度高的小鼠进行细胞融合。细胞融合实验前4天，将100-200µg庆大霉素- BSA加入PBS (0.01 M, pH 7.4)腹腔注射。用聚乙二醇(PEG1450)将小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合。融合后，将融合后的细胞置于96孔细胞培养板中，在HAT培养基中增殖。在细胞融合后7-10天，通过间接竞争ELISA筛选阳性杂交瘤细胞，并通过极限稀释法进行亚克隆。

3、icCLEIA的发展与优化

棋盘法检测包被抗原浓度和抗庆大霉素单抗稀释倍数。优化免疫反应时间、二抗稀释度、二抗反应时间和发光检测时间，提高检测灵敏度。在优化条件下对icCLEIA的灵敏度进行评价。x轴为庆大霉素浓度的对数，B/B₀ (B)为庆大霉素指示浓度下的平均RLU;B₀为庆大霉素零浓度时的平均RLU。按照B/B₀ - logC绘制庆大霉素标准曲线，并通过Origin8.5计算庆大霉素标准曲线的检出限(LOD)、IC₅₀和线性范围(IC₂₀-IC₈₀)。结果如图1所示。

图1所示。不同工作条件对icCLEIA敏感性的影响(n = 3). A:竞争性免疫反应时间;B:二抗孵育时间;C:二抗稀释倍数;D: RLU值检测时间。

4、交叉反应性

图2所示。庆大霉素icCLEIA标准曲线(n = 3)

图3所示。抗庆大霉素单抗与庆大霉素类似物的交叉反应性

5、icCLEIA的恢复及其与UPLC-MS/MS分析的相关性

采用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)对本地市场的猪肉和鱼类样品进行了阴性检测。阴性样品分别加入0、0.375、0.75、1.5 μg浓度的庆大霉素。由于猪肉和鱼类样品中含有多种蛋白质和脂质，在样品预处理时采用三氯乙酸沉淀蛋白质，正己烷提取脂质。样品提取后，采用icCLEIA和UPLC-MS/MS对提取物进行分析。为了减少样品成分的潜在干扰，提取液在分析前用PBST适当稀释。在猪肉样品中，icCLEIA法对庆大霉素的平均加样回收率为81% ～ 101%，变异系数为3.7% ～ 6.4%;UPLC-MS/MS法对庆大霉素的平均加样回收率为96% ～ 106%，变异系数为0.2% ～ 5.1%。在鱼类样品中，icCLEIA的平均回收率为80% ～ 100%，CV值为0.8% ～ 6.3%;UPLC-MS/MS的平均回收率为100% ～ 105%，CV值为0.8% ～ 3.2%。结果表明，该方法可作为动物食品中庆大霉素残留快速、高效的筛选方法。

【结论】

本研究将庆大霉素半抗原与牛血清白蛋白(BSA)和卵细胞(OVA)结合制备免疫原和包被抗原，通过免疫小鼠和细胞融合实验获得了几个高亲和力的抗庆大霉素阳性杂交瘤细胞。以特异性杂交瘤阳性细胞40H6为原料制备腹水单克隆抗体，经亲和层析纯化。以纯化腹水单抗为基础，建立了用于庆大霉素动物组织检测的高灵敏度icCLEIA, IC₅₀为0.067 ng/mL, LOD为0.002 ng/mL，与结构类似物的交叉反应性<0.01%。庆大霉素在猪肉和鱼类样品中的回收率为80 ～ 101%，变异系数小于6.4%。与以往报道的庆大霉素检测方法相比，本研究开发的icCLEIA具有更高的灵敏度和特异性。通过与UPLC-MS/MS的比较，验证了icCLEIA方法的可靠性和准确性。因此，本研究建立的icCLEIA方法可作为常规筛选庆大霉素在动物性食品中残留的有力工具。