一、实验简介：

　　Western blot是一种分子生物学实验技术，通过 SDS-PAGE 凝胶电泳将蛋白按照分子量大小分离，然后利用特异性抗体标记这些蛋白。在免疫检测中，通常使用硝酸纤维素或 PVDF(聚偏二氟乙烯)膜作为传递介质。将凝胶紧贴膜后，通过电流作用使蛋白从凝胶迁移到膜上。接着使用特异性抗体进行进一步处理，通过次级抗体和检测试剂使膜显色，从而检测目标蛋白。Western blot技术在生命科学研究中被广泛应用，能够检测蛋白的表达和定量，帮助科研人员更好地研究蛋白的结构和功能。

二、实验步骤

1、处理样品前准备：

　　(1)将培养皿或培养瓶放在冰上，用冰冷的 PBS 缓冲液洗涤细胞。

　　(2)吸干 PBS，然后添加适量的冰冷细胞裂解缓冲液(每 107 细胞/100 mm 培养皿/150 cm2 培养瓶加入 1 ml;每 5×106 细胞/60 mm 培养皿/75 cm2 培养瓶加入 0.5 ml)。

　　(3)用预冷的塑料细胞刮板刮下贴壁细胞，将悬浮细胞液轻柔地转移至预冷微量离心管中。

　　(4)在 4 ℃ 下持续搅拌 30 分钟。随后进行超声处理。以探头超声仪为例，设定功率为 40W 或总功率的 40%，进行多次打 3 秒停 3 秒的超声处理，每次超声 5-10 次。超声后，裂解液将变得清澈且不再黏稠。加入Loading缓冲液后进行煮样。注意：跨膜蛋白不宜煮样，直接加入Loading缓冲液;(若使用水浴超声，则适当延长时间，超声 30 秒至 2 分钟，全程保持在冰浴环境中)。

　　(5)若无超声仪，可使用带注射器的针头(20G-18G-16G)在冰上多次抽吸，直至裂解液变清澈。

2、解剖样品前准备：

　　(1)使用干净的器械在冰上解剖目标组织。为防止蛋白酶的降解，最好在尽快完成解剖过程。

　　(2)将解剖好的组织放入圆底离心管或 Eppendorf 管中，立即浸入液氮中进行“速冻”。将样本存储在 -80°C 中备用，或者立即放在冰上进行匀浆处理。对于约 5 mg 的组织，迅速向管中加入约 300 μL 裂解液，并使用电动匀浆器匀浆。使用 2 倍裂解液两次冲洗刀片，每次使用 200 μL，然后在 4℃ 下(例如将回旋振荡器放入冰箱中)持续振摇 2 小时。裂解液的体积应根据组织总量来确定;蛋白提取物不宜过于稀释，以免造成蛋白丢失，同时尽量减少样本体积，以便于在凝胶上进行上样。最小浓度为 0.1 mg/mL，最佳浓度为 1-5 mg/mL。

　　(3)在微型离心机中以 4℃ 和 12,000 rpm 的速度离心 20 分钟。轻轻地从离心机中取出离心管放置在冰上。将上清液吸出并转移到新的预冷离心管中，将沉淀废弃。

3：上样和电泳步骤：

　　(1)将相等量的蛋白质和分子量标准上样到 SDS-PAGE 凝胶槽中。来自细胞裂解物或组织匀浆的总蛋白的上样量通常为 20 - 30 μg，而纯化蛋白的上样量为 10 - 100 ng。

　　(2)在设定电压为 100 V 的条件下进行电泳，通常需要 1 至 2 小时。根据蛋白的大小、仪器条件等因素，可能需要对电泳时间和电压进行一些优化。

　　(3)建议设定内参对照。根据蛋白的类型，可以使用全蛋白内参、核蛋白内参、膜蛋白内参以及不同亚细胞器的内参，以确保电泳结果的准确性

4：蛋白从凝胶转移到膜：

　　可以选择硝酸纤维素或 PVDF 作为转膜膜材料。对于 PVDF 膜，在转膜之前用甲醇活化 PVDF 膜约 1 分钟，然后用转膜缓冲液冲洗 PVDF。转膜的时间和电压可能需要根据实验条件进行优化，建议参考生产厂家的说明书进行操作。在进行封闭步骤之前，可以使用丽春红染色法检查蛋白质转膜的效果。

　　制备转膜层的步骤如下：

　　5：抗体染色步骤：

　　(1)使用5%封闭溶液在室温下封闭膜 1 小时，或者在4℃下过夜进行封闭。

　　(2)使用适当稀释度的一抗在5%封闭溶液中在4℃过夜或在室温下孵育2小时。

　　(3)用TBST洗涤膜3次，每次5分钟。

　　(4)使用推荐稀释度的标记二抗在含有5%封闭缓冲液的TBST中在室温孵育膜1小时。

　　(5)用TBST洗涤膜3次，每次5分钟，然后用TBS冲洗。

　　(6)去除多余试剂，利用暗室显影技术采集化学发光图像，或者使用常规图像扫描法采集比色检测图像。