摘要：

　　基因工程技术可充分利用抗体天然结构，彻底改变了免疫学。单链抗体(scFv)是基于重组抗体技术的典型生物制剂。scFv是通过短柔性肽linker将重链和轻链可变区的基因连接成单个转录本，从细胞和合成文库中生成的片段。scFv分子的特异性和亲和力与亲本抗体大多数情况下相当。与标记蛋白和其他分子融合可提高其稳定性、循环半衰期、活性和纯化效率。本文还介绍了包括scFv的构建方案、治疗和诊断应用以及相关的挑战。

　　1.引言

　　单克隆抗体(mAb)具有表位特异性，因此可以对它们进行重组调整，以靶向参与潜在病理状况的特定分子。这一特性使mAb在解决与其相关的治疗和诊断限制方面，与多克隆抗体不同。此外，mAb可以通过嵌合或人源化杂交瘤制备，并且可以识别人类表位，克服了免疫原性的风险。人源化抗体已成功用于治疗多种人类疾病，包括癌症、自身免疫性疾病、心血管疾病和几种神经系统疾病。然而，mAb仍然不足以针对所有靶标，因为某些抗原分子与特定病理环境有关，具有非常隐蔽的性质。此外，mAb对实体瘤的渗透及其瘤内分布受到限制。这影响了它们在分子成像和治疗领域的应用效力。因此，研究人员开始寻找替代的抗体设计形式。重组抗体技术能够生产具有不同修饰特征的抗体，对其他生物分子具有高亲和力和特异性。

　　重组抗体片段是目前最热门的研究领域，与全长mAb相比，重组抗体片段具有不同的特性。与传统抗体相比，通过抗体工程、分子克隆甚至酶技术，可以更经济、更直接地生产片段分子。与以前的技术方案不同，这种新范式为新的治疗学科创造了一个平台，能够靶向与特定病理疾病有关的分子。目前存在几种抗体片段，最著名的是单链抗体(又称单链可变片段，scFv)、单结构域抗体、抗原结合片段(Fab)和可结晶片段(Fc)结构域。scFv Ab 包括可变重(VH)和可变轻(VL)链，具有较小的尺寸，可以从各种文库中获得。它可以被设计成更大的多聚体形式，如双特异性、三价双特异性、四价双特异性抗体衍生物和偶联形式，适用于多种应用。本文讨论了scFv的研究进展和在治疗和诊断中发挥的作用。

　　2.1. scFv的设计变体

　　scFv 由可变区(包括重链和轻链)的基因生产，这些基因通过短柔性linker肽在基因上构建在单个转录本中(图1a)。其通常能够以与亲本抗体相同的特异性和亲和力结合靶抗原。其平均分子量为 27 kDa，被公认为是具有 VH 和 VL 结构域的所有抗体片段中最小的功能性免疫球蛋白单元。VH-linker-VL和VL-linker-VH排列都可以产生有用的scFv，但在某些情况下，scFv在一种构象中的表现优于另一种构象。

　　linker肽的长度和序列在确定scFv抗体的结合特性、特异性、折叠和溶解度方面起着重要作用。linker大多在15-20个氨基酸序列内，富含甘氨酸和丝氨酸残基，也可以优化到多达35个氨基酸。linker在两个可变结构域的羧基和氨基末端之间的距离为3.5nm(35 Å)。富含甘氨酸-丝氨酸的linker序列因其柔韧性而最常用。不过体外研究表明，linker中的重复序列在基于PCR的实验中存在问题，似乎具有免疫原性，并且与非重复linker相比，稳定性较差。此外，丝氨酸，特别是和其他带电残基，如谷氨酸和赖氨酸，如果包含在linker序列中可以提高scFv的刚性和溶解度。

　　通过设计不同的linker，可产生各种形式的多聚体，如二聚体、三聚体和双特异性抗体。关于linker序列设计，最初由Huston等设计使用的15-聚体(G4S)3，是五肽GGGGS的多聚体。此后，(G4S)n接头氨基酸序列基序用作基本支架，其中18-聚体GGSSRSSSGGGGSGGGGG和20-聚体(G4S)4是一些常用的多聚体。

　　根据所采用的 scFv 抗体和linker肽的数量，生成了基于 scFv 的不同形式的抗体结构。例如，串联 scFv 通过 NH2-VL1-VH1-(linker-VL2-VH2)n-COOH 构型中的螺旋肽linker在单个转录本中连接两个或多个 scFv。这些结构生成具有双价和/或双特异性结合位点的生物制剂，可以以更大的亲和力靶向特定抗原，或同时靶向两个不同的抗原(图1b和1c)。

　　scFv抗体可以通过多聚化技术进一步修饰，增加其分子量、亲和力和灵敏度。也可以通过来自两种不同抗体分子的两条不同链的相互作用来修饰，称为二价二聚体(diabody，图1d)。其中一种形式称为双亲和重靶向蛋白(DART)，使用两条不同的链生成双特异性二价二聚体，其中第一条链包含来自抗体 1 的 VH 和来自抗体 2 的 VL，第二条链包含来自抗体 2 的 VH 和来自抗体 1 的 VL(图 1e)。然后在两种多肽之间添加链间二硫键，提高分子的稳定性，降低同型二聚体的聚集程度。此外，通过在一条链中连接三个或多个可变结构域，可以以类似于二元体的方式产生三价、四价(图1f)或五价结构。

　　图1 scFv抗体及其他scFv形式的示意图。

　　(a) scFv抗体：VH的C末端通过一个富含甘氨酸和丝氨酸残基的灵活肽链连接到VL的N末端。

　　(b) 由两个相同的scFv构成的二价单特异性串联scFv，通过螺旋链连接。

　　(c) 由两个不同的scFv构成的二价双特异性scFv，通过螺旋链连接。

　　(d) 双特异性scFv形式由两个分开的链组成，每个链包含来自不同抗体的VL和VH，以头尾排列。

　　(e) 双特异性双DART®形式scFv由两个不同的多肽链组成，通过非共价键和二硫键的相互作用连接在一起。

　　(f) 四价双特异性分子(TandAb)由两个diabody以线性排列连接构成。

　　2.2. scFv抗体的优点

　　与全长单克隆抗体相比，scFv 抗体具有多项优势，包括其固有特性，如大小、免疫原性效应、表达和生产系统。

　　(1)scFv 抗体的尺寸较小(Mwt为27 kDa)，即比完全抗体(150 kDa)小五分之一，因此易于穿透肿瘤组织并到达隐秘表位。

　　(2)由于其体积小，其从血液和非靶组织中的快速清除能力得到了增强。

　　(3)scFv抗体分子可以在微生物表达系统中轻松生产和操作，该系统可以在短时间内以较低的成本产生更高的剂量。

　　(4)scFv 的免疫原性较弱，因为它们缺乏激活抗体效应器功能的 Fc 结构域。

　　(5)scFv具有与亲本抗体相同的抗原结合能力，甚至可以与其他潜在分子偶联，以提高其活性、稳定性和亲和力，从而更倾向于结合靶分子。

　　2.3. scFv抗体的产生

　　产生scFv抗体的基本方案如下所示(图2)。

　　图2 制备scFv抗体的基本程序。从重排的可变基因片段中获得的抗体库可以来源于原始B细胞、激活的B细胞和通过计算机模拟获得的合成库。经过mRNA富集后，使用PCR组装scFv库，并将其克隆入噬菌体载体中，从而在噬菌体表面表达scFv库。将噬菌体库与目标配体孵育后，进行洗涤步骤以去除所有未结合的噬菌体。所有结合的噬菌体被洗脱并在大肠杆菌中扩增，这些噬菌体可用于进一步的筛选，以获取特异性结合子。

　　2.3.1. mRNA的分离和VH和VL基因的PCR扩增

　　目前，由免疫文库和通用文库组成的几种细胞和合成抗体文库已被用作生成多种抗体形式的来源(图2)。免疫文库是从免疫动物或人类组织或血液(如骨髓、外周血单核细胞(PBMC)、脾脏、杂交瘤细胞系和任何细胞成分的样本中产生的。通用库分为天然库、合成库和半合成库。天然文库来源于未免疫供体的重组Ig V基因，具有组合性质，在文库构建过程中，重链和轻链随机组合。合成文库是利用分子生物学技术开发的，目的是增强重组抗体。半合成文库通常来源于天然抗体和合成抗体序列的组合。

　　对于免疫和非免疫供体，通过分离总 RNA产生编码 VH 和 VL 抗体结构域的基因片段。进行逆转录以产生cDNA，cDNA被用作相关基因PCR扩增的模板(图2)。使用正向和反向引物，扩增 cDNA 片段可创建一个包含各种 VH 和 VL 抗体基因的庞大文库。

　　2.3.2. 接头肽的引入和全长scFv结构域的克隆

　　linker编码一个15肽(Gly4Ser)3，该肽位于VH和VL PCR扩增产物之间。首先，linker分别添加在每个可变区的前后，然后使用重叠延伸PCR(SOE-PCR)的两步法进行组装。在组装PCR中，VH和VL区域应以等量存在，但可以降低linker引物的浓度，以防止某一域的优先扩增。PCR产物通过凝胶电泳进行验证，随后将适当的片段送去测序平台进行测序。生成完整的scFv，其方向可能为VH-(Gly4Ser)3-VL或VL-(Gly4Ser)3-VH，并通过设计的引物进行克隆。

　　2.3.3.载体克隆、噬菌体展示和转化

　　编码scFv抗体的基因插入到噬菌体内，并连接到DNA的C末端区域，而展示的肽则附着在基因的外部N末端。用于噬菌体展示的噬菌体有几种，但最常用的是丝状噬菌体M13，还有其他噬菌体，如Lambda、T4和T7也被使用。M13对宿主细菌无裂解作用，并通过细菌细胞膜分泌产生噬菌体颗粒。M13拥有两个结构蛋白用于抗体片段的表达：基因III和VIII。由于表面展示的肽拷贝数较少，基因III蛋白被广泛使用。

　　按照相关PCR的标准方案，将scFv抗体编码片段与噬菌体外壳蛋白基因融合。然后，将线性PCR产物扩增并环化，再通过电穿孔或化学诱导的感受态转化到E. coli细胞(如XL1-Blue、TG1和ER2537)中(图2)。为了释放包含所需片段的克隆载体，感受态细菌会感染辅助噬菌体，如VCSM13、M13KO7等。E. coli随后会生产大量展示各种肽序列的噬菌体，通常大小为10^6到10^11，具体取决于所研究的文库类型。从中构建并筛选抗体可变区文库，以寻找对特定分子(如酶、抗体和目标细胞的表面受体)具有高亲和力的肽。这些体外筛选过程称为生物淘选(biopanning)。通过这个过程，可以确定小片段抗体对目标抗原的结合力、亲和力和结合动力学。

　　淘选步骤包括：将展示文库与固定在固体支持物(如珠子、膜等)上的配体进行孵育;通过洗涤缓冲液去除未结合的噬菌体;洗脱结合的噬菌体;并将其重新感染E. coli细胞(图3)。最终，会生成一个每个噬菌体表面上都表现出单一抗体片段的噬菌体文库。通常会使用多轮结合(大多数情况下四到六轮)和扩增来选择展示抗体片段并紧密结合目标分子的抗原特异性噬菌体克隆。最后，通过DNA测序对每个克隆进行标记，以揭示它们不同的CDR(互补决定区)。

　　图3 噬菌体展示筛选示意图。将编码目标scFv的基因片段与噬菌体外壳蛋白编码基因融合。展示scFv抗体的噬菌体文库通过与抗原(以其天然形式存在)孵育进行亲和力选择，抗原可以固定在磁珠或固体表面上。所有未结合的噬菌体(或弱结合)通过洗涤去除，而牢固结合的噬菌体则通过改变pH条件回收。E. coli细胞与辅助噬菌体共同感染释放新噬菌体颗粒，用于随后的筛选周期，这些周期通常包括3到4轮。最后，通过噬菌体酶联免疫吸附试验(phage ELISA)对结合物进行富集，并随后回收所需的scFv抗体。

　　2.3.4. scFv抗体的表达

　　展示技术有助于在单个实验中快速筛选多个抗体片段，并产生具有高特异性的纯抗体分子。小片段分子已使用多种表达系统成功展示，包括真核细胞表达系统(基于酵母和哺乳动物细胞)、原核细胞表达系统(基于细菌细胞)和无细胞表达系统(核糖体展示)。

　　(1)原核细胞表达系统。因为原核细胞表达系统价格低廉，并且可以在实验室环境中快速生长。因此，可以在生物反应器的大规模培养过程中产生高生物质和蛋白质产品。使用最广泛的可能是大肠杆菌表达系统，其基因组简单且易于分析，表达产量较高。但表达的蛋白产物缺乏翻译后修饰和正确的折叠，因此，需要通过各种变性剂进行额外的增溶，并在纯化后进行进一步的体外复性步骤。

　　(2)真核细胞表达系统。对于真核细胞表达系统，最常用的菌株是来自真菌界的单细胞酵母，包括毕赤酵母(Pichia pastoris)和啤酒酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。它们在培养中生长得速度快，并且能提供比任何其他表达平台(如杆状病毒和哺乳动物组织培养)更高的表达水平。它们还具有真核细胞的许多优点，包括蛋白质加工、蛋白质折叠和翻译后修饰。

　　(3)无细胞表达系统：核糖体展示技术。

　　基于表型与基因型固有关联性，针对目标配体筛选有效抗体的体外选择方案。其主要目的是解决细胞和噬菌体展示方法的缺陷，通过体外生成三元蛋白-核糖体-mRNA复合物。在选择过程中，mRNA-蛋白复合物会结合到固定的配体上，从而暴露复合物中的mRNA，进行体外逆转录生成cDNA序列，最终通过PCR扩增。随后，通过3-5轮筛选获得特定的抗体片段(图4)。特定产物的DNA编码文库被连接到一个由终止密码子阻断的间隔序列上。在体外翻译过程中，间隔序列与肽基tRNA连接，占据核糖体的轴。这样，正确折叠的目标蛋白会从核糖体复合物中突出，结合到固体表面上的固定配体上。常用的表面材料包括硝酸纤维素、柱状基质、磁珠、聚苯乙烯管和96孔微量滴定板。在洗涤步骤中，所有未结合的复合物会被清除。而结合的复合物中的mRNA通过原位RT-PCR被回收。最终，通过ELISA确认所有识别的抗体克隆，并在必要时进一步进行体外亲和力成熟步骤，以提高小片段分子的稳定性和/或亲和力。然后，对个体结合剂进行测序和进一步的生化特征分析。这些方法有效地筛选出大量编码DNA文库，选择高亲和力的结合位点，因为没有细胞培养的参与，与其他受转化效率和翻译后修饰限制的展示技术相比更加高效。

　　图4 体外核糖体展示示意图。首先，免疫供体生成感兴趣的scFv抗体的DNA文库。经过mRNA富集处理以获得VH和VL片段的文库后，通过体外翻译生成含有目标生物体的三元蛋白–核糖体–mRNA复合物。该复合物通过结合目标配体进行选择。接下来，回收scFv的DNA文库，并对其进行扩增，以便进行进一步的选择循环或后续分析。因此，DNA文库可以通过体外转录与翻译耦合的方法一次或多次扩增，形成mRNA、相关的生物体以及核糖体复合物(PRM复合物)，该复合物通过与固相上的抗原结合进行选择。

　　2.3.5. scFv抗体的纯化

　　在其生产周期和表达系统中，抗体片段可能会被杂质污染，包括内毒素、内源性病毒、宿主细胞蛋白、DNA 和其他聚集体，这些物质应通过有效的纯化方法去除。用硫酸铵、聚乙二醇、依沙吖啶和辛酸处理的初步步骤可用于增加抗体片段的浓度。然而，沉淀的纯度、选择性、重现性和产量会受到多种因素的影响，如温度、时间、pH 值和盐化速率。用于表达的细菌菌株也会影响细胞质中二硫键的形成。

　　表达系统的差异也使片段分子需要经过不同的纯化步骤。因此，在大肠杆菌细胞质中表达的抗体片段首先通过裂解细胞而释放，用不同的去污剂溶解，然后重新折叠至其适当的构象，这与通过细菌包膜从周质空间分泌的抗体片段不同。此外，抗体可以根据其一般的、可预测的结构、大小和化学性质，以及对特定类别抗体(如 IgG、IgM、IgA、IgD 和 IgE)具有更强亲和力的蛋白质的相互作用以及由它们衍生的片段结构进行分离。建议采用多模式纯化方法，通过各种层析平台相互结合、与亲和标签偶联以及非层析方法，以获得所需应用的高纯度抗体片段。

　　3. scFv抗体的应用

　　目前，基于scfv抗体的免疫疗法和诊断在肿瘤学、自身免疫性疾病、神经病变、慢性炎症性疾病和各种传染病中受到高度重视。scfv也可用于食品危害因子检测，例如抗生素、毒素、过敏原、非法添加剂、杀虫剂和化学品等。

　　3.1. 治疗

　　目前有近 1,200 种治疗性抗体处于临床试验阶段。其中约175例正在接受监管审查，约140例正在接受关键的2期、2/3期或3期临床试验(称为“late-stage”)的评估。此外，预计将有700多个mAb用于临床前和临床开发。根据美国食品和药物管理局(US FDA)的数据，这些mAb中有106种被批准用于癌症治疗。由于缺乏 FcR，传统mAb募集 T 细胞的能力有限。因此，大多数基于 scFv 的形式被设计为多特异性，以实现将 T 细胞的细胞内信号转导结构域 (CD3+) 与特定肿瘤抗原家族相连的潜力。所有双特异性形式都具有高于单价片段的亲和力和特异性。由于其尺寸微小，scFv抗体主要与其他分子偶联，以产生具有高亲和力和特异性的蛋白质，用于靶向治疗和揭示几种疾病病理，如癌症、自身免疫综合征、神经退行性疾病等。

　　3.2分子生物成像

　　基于scFv的分子生物成像可以改善现代治疗和精准医学的诊断和治疗应用。在大多数情况下，传统的成像方法不是靶向的，在检测疾病阶段时灵敏度较低，可能会误导医生的决策。但基于 scFv 抗体的成像是针对确定的抗原的，因此可以快速诊断病理状态，并且由于它们从血液中快速清除，可以被用作成像探针。如果scfv被设计为通过与荧光蛋白或酶融合来产生灵敏的检测探针，它们将成为诊断耐药病原体和相关生物膜的良好替代品。

　　3.3食品中危害因子的检测

　　免疫分析是现场快速筛查的常用方法。在免疫传感分析中，特异性抗体被用作传感器材料表面的生物识别元件，以便能够检测这些危害因子。当前已有研究应用scfv开发快速免疫分析方法，例如scFv 与 IC-ELISA 的结合是可靠的方法之一，可以轻松检测抗菌剂。例如，通过噬菌体展示和定向进化成功构建了针对环丙沙星的scFv(CIP)。同样，针对抗生素诺氟沙星的scFv和针对氨苄青霉素的scFv作为碱性磷酸酶融合蛋白有效地从杂交瘤细胞中构建出来。此外，基于 scFv 的杂交基因，可以同时检测三种抗生素，包括氯霉素 (CAP)、环丙沙星 (CPFX) 和磺胺嘧啶 (SM2)。另一种设计的scFv抗体也固定在羧酸磁珠表面，以高灵敏度和特异性有效捕获鸡肌肉中的马杜拉霉素抗生素残留。

　　4. scFv抗体的挑战和局限性

　　4.1 scfv抗体自身的局限性

　　(1)scFv 抗体中缺少 Fc 结构域使得该分子的热稳定性不如亲本 mAb，而缺乏 Fcrn 介导的再循环使分子容易出现较短的循环半衰期。

　　(2)同样，生物制剂的微小尺寸促进了聚集趋势，从而产生具有增加免疫原性风险的分子。从循环中被快速清除导致需要更高和重复的剂量。将 scFv 与牛血清白蛋白 (BSA) 或聚乙二醇 (PEG) 融合的方法可能提高其半衰期保留率，但由于分子大小的增加和实验成本的增加，它们的劣势也可能盖过scFv相较于mAb的优点。

　　(3)linker肽的组成可以影响目标生物制剂的理化性质及其体内活性。重复linker被认为会导致与基于PCR的方法和免疫原性相关的问题。替代的非重复linker已被用于改善其体内活性，但与重复linker相比它们的灵活性较差。

　　4.2 scfv抗体发现技术存在的挑战

　　与生成重组全长抗体相关的挑战同样适用于小片段抗体分子，包括但不限于使用生物工程重组抗体、表达、纯化、安全性和稳定性控制平台的技术。

　　(1)噬菌体展示技术用于产生全人源或人源化的scFv抗体分子，存在实验复杂性、时间长、生产成本高等问题。

　　(2)使用整合了人类免疫球蛋白位点的转基因动物，需要将重组基因整合到新产生的宿主动物中，程序繁琐。

　　(3)为产生具有VL和VH结构域自然组合的天然人类抗体而开发的单B细胞技术涉及诸如荧光激活细胞分选(FACS)和微孔板等筛选技术，以找出表达目标抗体的单细胞，仍然是非常昂贵的过程。

　　4.3 scfv表达系统的局限性

　　(1)使用的表达系统限制了scFv 抗体的构象折叠和产量。原核系统在表达过程中缺乏蛋白质糖基化，还会形成内毒素，难以从培养基中去除。

　　(2)真核生物单细胞表达则存在内质网(ER 内分子错误折叠的问题。尽管哺乳动物细胞系可用于减轻蛋白质折叠和糖基化模式的限制，但这些细胞系之间的遗传变异性可能会将不同的末端聚糖表位添加到与人类自然构象不同的重组蛋白中，因此可能不是生产抗体片段的良好平台。

　　(3)最近开发的转基因植物表达系统也受到提取、纯化程序和微生物表达系统等有限糖基化模式的影响。

　　(4)使用昆虫细胞的杆状病毒表达载体系统也受到N-连接糖基化的翻译后修饰的限制，以及由于病毒以裂解方式感染昆虫细胞而导致的转染困难，妨碍了重组蛋白在批量培养中的持续生产。

　　(5)另一方面，scFv 抗体蛋白的纯化更为复杂，因为其结构中没有 Fc 结构域。因此，无法通过蛋白A或蛋白G亲和层析进行纯化，需要多模式操作，包括不同的色谱和非色谱相互作用。为了选择性捕获和高效纯化，scFv抗体通常会融合亲和标签，但在末端的蛋白酶切割可能无法完全去除标签，并留下部分残余氨基酸，这可能导致scFv抗体的聚集和/或错误折叠，甚至增加其免疫原性。

　　5. 未来展望

　　(1)将scFv抗体与其他免疫分子如细胞因子或趋化因子进行基因融合，可以有效地将抗体分子定向到疾病区域或在病理条件下表达的特定分子上。减少了抗体片段对健康细胞的不利影响，从而通过靶向其生物活性来提高其治疗指数。此外，scFv抗体具有更强的灵活性，由于其片段小，可以被修饰以解决全长mAbs在实体瘤治疗和诊断中相关的疗效问题。

　　(2)抗体分子通常局限于细胞外环境，因为它们无法穿越脂质双层。但scFv抗体可以通过与纳米载体、细胞穿透肽结合，或构建具有识别细胞表面受体的序列结构，从而通过受体介导的内吞作用进入目标细胞。因此，它将仅识别癌细胞的目标分子，减轻化疗和放疗带来的副作用。

　　(3)由于重组抗体技术的不断发展，scFv抗体的分子量、结合亲和力、化合价等特性可以根据应用目的进行大幅度的修改和优化。生产成本、与治疗费用相关的上市后问题以及药代动力学特性都有望得到大幅改善，有望解决制药公司和患者的巨大经济负担。

　　(4)除了用于亲和力选择的展示技术外，利用生物信息学能够更容易地分析所研究的scFv抗体结构中的诱导突变，特别是针对CDR，通过随机或热点诱变来预测其对天然抗体的高亲和力特性。