BCA法的原理

　　BCA法又被称为Smith法，是由Pierce公司的Paul K. Smith等人在1985年对Lowry法进行改进，提出用BCA代替Folin-酚试剂而建立的(Smith, P.K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem.1985,150:76-85.)。

　　该方法的原理是，在碱性条件下，蛋白质中的肽键与Cu2+络合，同时将Cu2+还原为Cu+，BCA螯合Cu+形成紫色络合物，测定562 nm 的 OD 值来计算蛋白质浓度。

BCA究竟是怎么与蛋白质反应的？

　　要回答这个这个问题，首先需要了解BCA法涉及的两个反应步骤：首先是双缩脲反应，在碱性条件下，蛋白质中的肽键与Cu2+络合，同时将Cu2+还原为Cu+;接下来，2个BCA分子螯合1个Cu+，形成紫色络合物。

那双缩脲反应是如何进行的？又是如何将

双缩脲反应原理:

　　首先，脲就是尿素，两分子尿素在一定的条件下(180℃左右加热)，生成一个分子氨(NH3)缩合得到双缩脲。正是因为该物质是由两分子脲缩合而成的，故名双缩脲。

　　双缩脲在碱性溶液中能与极稀的硫酸铜溶液形成紫色络合物，这个呈色反应叫做双缩脲反应。

　　双缩脲试剂最初是指能够提供碱性条件和铜离子、用以鉴定或检测双缩脲存在的试剂。由于蛋白质分子中含有很多与双缩脲结构相似的肽键，因此也能与铜离子在碱性溶液中发生双缩脲反应，且颜色深浅与蛋白质的含量的关系在一定范围内符合比尔定律，而与蛋白质的氨基酸组成及分子量无关，故可用双缩脲法测定蛋白质的含量。

那为什么肽键能与铜离子形成紫色络合物呢？

　　络合物又称配位化合物。凡是由两个或两个以上含有孤对电子(或π键)的分子或离子作配位体，与具有空的价电子轨道的中心原子或离子结合而成的结构单元称络合单元。

　　铜的外层电子组态是3d104s1，一般的铜会失去两个电子，其外层电子组态是3d9。九个电子占据5个d轨道，必然还会有一个轨道上是单电子。所以铜离子容易与肽键上带有孤对电子的氮形成络合物。但由于Cu2+为d9构型，使得姜-泰勒效应较为显著，会发生晶体场形变(拉长)，四边形平面上连接氮的四个键较短，而H2O的两个键较长。

那为什么双缩脲反应要在碱性条件下？

　　蛋白质双缩脲反应实质是肽键络合Cu2+，肽键是酰胺键的一种，其pKa大约为-0.5，当pH=-0.5时，有50%酰胺质子化，当pH-pKa>2时，几乎所有酰胺都去质子化。在强碱(pH 11.25)条件，可以促使肽键中N上的H+部分电离，电子云密度增大，易于和Cu2+配位，形成紫色螯合物。

那双缩脲反应又是如何将Cu

　　生物化学定义，肽键是氨基酸分子间的氨基和羧基脱水缩合而形成的化学键，因缩合产物称为肽，故名肽键。其中氮原子上的孤对电子能与氧原子形成配位共价结合而具有还原性，但是C-N键中氮原子上的孤对电子与相邻羰基上的π电子共同组成三中心四电子的离域π键(π34)，分散了氮原子上的孤对电子;再加上羰基氧原子吸电子作用也使氮上电子云密度降低，导致氮原子结合氧原子能力减弱，具有弱还原性。

　　但是在强碱(pH 11.25)条件，可以促使肽键中N上的H+部分电离，电子云密度增大，使得氮原子结合氧原子能力增加，还原性增加，可以将Cu2+还原成Cu+。

　　同时，由于蛋白质肽键-Cu2+络合，使得肽链展开，蛋白质中色氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、胱氨酸等还原性氨基酸残基充分暴露，也可以将Cu2+还原成Cu+。

那接下来，BCA又是如何螯合Cu

　　当Cu2+被蛋白还原成Cu+，Cu+与蛋白质肽键的络合能力变弱，此时BCA竞争性、特异性地络合Cu+，形成稳定的紫色络合物。

　　此步骤还涉及三个问题：1. BCA为什么不与Cu2+络合;2. 为什么肽键能与Cu2+稳定络合，而与Cu+的络合能力减弱;3. BCA是如何与Cu+络合的。

　　可能的原因：Cu+的价电子为3d10，处于全满状态，在非极性环境稳定，而在水中容易发生歧化反应生成Cu2+。Cu2+的价电子虽然为3d9，但是在极性水溶液环境中，由于其水合能远高于Cu+，反而更稳定。一是Cu2+电荷更高，半径更小;二是由于Cu2+的d9结构，在水分子的配位场作用下，发生d轨道能级分裂，得到了配位场稳定化能和姜-泰勒畸变稳定化能，在水中变得更稳定。

　　所以，Cu2+在缓冲液中不与BCA络合，因为BCA带有疏水芳香环，而更容易与蛋白质肽键和水分子络合;当Cu2+被还原成Cu+，其与肽键的络合作用减弱，反而与BCA形成稳定络合物，也是因为BCA提供了疏水芳香环，再加上芳香环的刚性稳定性和离域π电子共轭体系，形成的络合物更稳定。`这也是BCA为什么可以和Cu2+混合在一起与蛋白质样品反应的原因，一是BCA不与Cu2+，配制在一起简化操作;二是Cu2+被还原成Cu+，BCA便可以快速与其形成稳定紫色络合物。

　　以上便是BCA测定蛋白质含量的化学生物学原理，结合了络合物化学，肽键化学，有机还原反应，Cu2+和Cu+络合物区别等相关化学生物学知识。

题外：

　　1.1893年，瑞士化学家维尔纳总结了前人的理论，首次提出了现代的配位键、配位数和配位化合物结构等一系列基本概念，成功解释了很多配合物的电导性质、异构现象及磁性。自此，配位化学才有了本质上的发展。维尔纳也被称为“配位化学之父”，并因此获得了1913年的诺贝尔化学奖。

　　2.BCA法有着高度的均一性，相对于Bradford染料结合方法而言，不同蛋白质之间的变异性更小。原因是，Bradford法主要是染料与蛋白质碱性氨基酸和芳香族氨基酸残基结合，不同蛋白质含有上述氨基酸残基量不同，导致变异性增加;而BCA法除了蛋白质中还原性氨基酸残基参与Cu2+还原成Cu+外(受到蛋白氨基酸序列中四个氨基酸残基(半胱氨酸、胱氨酸、酪氨酸和色氨酸)含量不同的影响)，蛋白质中无差别的肽键也参与还原过程，有报道称蛋白质肽键络合Cu2+，并将其还原成Cu+的比例占到75%，起主要作用，那蛋白质相互间的差异至少降低到25%以下，这也是BCA测量蛋白时候比Bradford法线性更好，测量准确性更高的原因。

　　3.尽管在BCA法中蛋白、铜离子和BCA之间的互相作用机制尚未得到清楚的阐述，但并不妨碍此方法在蛋白浓度测定中的广泛应用，据统计，此方法在Google学术的引用率超过14万次，是近年来蛋白浓度测定最常用的方法之一。

　　这也许就是实验科学，很多时候都是先观察得到现象与结果，然后再用一系列假说和原理试图去解释阐述。BCA方法从1985年发明至今已经37年，其涉及的作用机制依然未解释清楚。