一、前言
在生命科学中，在许多情况下，及时且经济高效地检测和定量样品中的抗原或抗体非常重要。从识别接种疫苗或感染个体的免疫反应，检测您希望在细胞表面表达的蛋白质的表达，到进行质量控制测试。拥有能够进行此类评估的工具是关键。
酶联免疫吸附测定 （ELISA） 就是这样一种测试，已被证明作为一种研究和诊断工具非常宝贵。在本文中，我们将考虑什么是 ELISA、它是如何工作的、技术的变化以及它可以告诉您什么。
二、什么是ELISA？
ELISA是一种免疫学检测方法，通常用于测量生物样品中的抗体或抗原，包括蛋白质或糖蛋白。与其他免疫测定一样，它们依赖于抗体与靶标的结合来促进检测。
通常，ELISA检测在96孔板中进行，这种形式使其适合一次筛选多个样品。血清、血浆、细胞培养上清液、细胞裂解物、唾液、组织裂解物和尿液都是用于这些分析的常见样品类型，但理论上可以使用大多数液体样品类型。然而，重要的是要考虑到某些样品类型可能包含抑制因子，例如具有相似抗原表位的缓冲液成分或蛋白酶等因子这可能会损坏靶标或检测组分，从而干扰检测的性能。
有几种不同的检测形式，但都依赖于靶标本身的结合或能够将靶标捕获到板表面的抗体/抗原的结合。然后采用涉及偶联抗原或更常见的抗体的检测步骤来检测和定量成功结合，最常见的是通过比色检测。
三、ELISA的类型和检测图
ELISA 最初是由瑞典斯德哥尔摩大学的Eva Engvall和Peter Perlman以及荷兰的Anton Schuurs和Bauke van Weemen于1971年互相独立发明的。他们寻求一种能够检测抗原或抗体存在的免疫测定方法来取代放射免疫测定，后者使用具有潜在危险的放射性标记抗原或抗体，从而设计了一种基于酶的替代方案。
现在有四种主要类型的ELISA，直接、间接、夹心和竞争。
下图说明了抗原的检测；然而，相同的原理基本上适用于抗体检测，抗原和一抗的作用是相反的。
ELISA 的类型
通过直接ELISA，样品中的抗原或抗体以非特异性方式直接吸附到检测板上。然后将对靶标具有特异性的偶联检测抗体或抗原应用于孔中。在此之后，使用检测底物产生可测量的颜色变化，该变化可以在读板器中量化。
由于该检测步骤少，因此与其他ELISA方法相比，它更快且引入错误的机会更少。但是，由于吸附步骤是非特异性的，因此背景噪声可能很高。没有二抗步骤意味着没有信号放大，从而降低了检测灵敏度。它还需要为每个所需的靶标创建偶联检测抗体/抗原。
直接ELISA
最初开发于1978年对于人血清白蛋白的检测，间接ELISA或iELISA的工作原理与直接ELISA 非常相似，只是增加了二抗步骤。这使得测试信号的放大成为可能，克服了直接ELISA的限制。它还消除了对靶标特异性偶联检测抗体/抗原的需求，因为偶联的二抗只需要对一抗具有物种特异性。当总样品抗原结合到板上时，如直接ELISA，背景噪声仍然是一个问题。但是，如果该检测用于检测样品抗体，则纯化的靶抗原被包被到板上，一抗来自样品。这大大降低了背景噪音，因此这些分析法在测定样品中的抗体滴度方面最受欢迎。
间接 ELISA 的缺点包括方案较长，出错的机会更多，并且可能与二抗发生交叉反应。
开发于1977年，顾名思义，夹心ELISA将抗原夹在抗体之间。该技术可以采用直接或间接 ELISA形式（上面描述的夹心ELISA基于间接ELISA），不同之处在于捕获抗体不是抗原与检测板的非特异性结合，而是使其成为一个特异性过程。这种组合进一步提高了检测的灵敏度和特异性。
然而，它们确实需要确定相容的捕获和检测抗体对才能有效发挥作用，而交叉反应性可能会有问题。这种分析通常也具有最多的步骤，因此出错的机会更大。由于抗原结合步骤的选择性，夹心ELISA在抗原处于复合物混合物中时特别有用，因为不需要抗原纯化。
夹心ELISA
竞争性ELISA，也称为抑制ELISA或封闭ELISA，可能是最复杂的ELISA技术。最初开发于 1976年对于人绒毛膜促性腺激素的检测，该检测通过检测对预期输出信号水平的干扰来工作，从而产生反比关系。所施加的样品中的靶标越多，检测输出信号就越低。有多种形式可供选择，其他ELISA类型可以适应竞争形式。但是，有两个一般原则；样品抗原或抗体与参比分别与有限量的标记抗体或抗原结合。或者，样品抗原或抗体可能与标记的参考物质竞争，分别与有限量的抗体或抗原结合。
竞争性ELISA将具有与其改编形式相同的一些优势和局限性。然而，当抗原较小时，它会有所帮助，如限制两种抗体同时结合的能力（如夹心ELISA的要求），或者当只有一种抗体可用时。
竞争ELISA
四、ELISA步骤
虽然不同类型ELISA的实验方案存在差异，但应考虑大多数检测的共同阶段。
大多数ELISA的第一步是将检测的第一组分与检测板结合。这通常是通过被动吸附完成的，这是一个非特异性过程，因此结果将取决于应用于板的物质。如果应用含抗原的样品，则结果是板仍然需要选择性步骤，因为各种抗原都会结合，而不仅仅是感兴趣的抗原。但是，如果应用纯化的抗原（如用于抗体检测的间接ELISA）或捕获抗体（如夹心ELISA的情况 ），则可直接包被。
根据检测的靶标和性质，可以使用多种板类型，其中大多数是聚苯乙烯或聚苯乙烯衍生物，具有不同的结合特性。一些靶标，包括高度糖基化的蛋白质、碳水化合物、DNA、脂质、短肽和去污剂存在下的蛋白质，不能很好地吸附。在这些情况下，建议使用经过处理以允许与表面共结合的板。
向ELISA板中添加试剂后，必须对其进行孵育，以便进行结合或反应。每次孵育的温度和持续时间将取决于检测步骤和所执行的操作。通常在37 °C下孵育1~2小时或4℃过夜。
洗板是每一个步骤留下预期待测物或抗体的重要步骤。从孔中清空溶液后，用缓冲液（通常是磷酸盐缓冲盐水-吐温20 （PBST））洗涤孔，以去除残留的任何未结合抗原、抗体或试剂。这可以使用多通道移液器或使用自动洗板机完成。洗涤不充分可能会导致背景信号高，而洗涤过多会导致样品信号低。不一致的洗涤可能会导致整个板不一致，从而导致结果不可靠。
在用蛋白质或抗体包被ELISA板后，通常需要封闭以防止以下方案步骤中检测抗体的任何非特异性结合。将与测定无关的混合蛋白加入板中并在板中孵育，占据任何可用的非特异性结合位点。常见的蛋白质封闭缓冲液选择包括脱脂奶粉、牛血清白蛋白（BSA）和酪蛋白等。或者，非离子去污剂，如Tween-20或Triton X-100，可用作封闭剂，但不能像蛋白质那样提供永久封闭。无效的板封闭会导致背景噪音增加并降低检测的灵敏度和特异性。
抗体是大多数ELISA的基石，选择合适的抗体至关重要，尤其是在使用多种抗体的情况下。单克隆抗体和多克隆抗体都可以使用，每种抗体都有自己的优点和局限性。单克隆抗体具有高度特异性，但成本更高。另一方面，多克隆抗体可以在多个结合位点结合靶标，从而放大信号并提高灵敏度。
使用采用二抗的方法会增加额外的步骤，延长检测时间，增加出错的机会，并且需要更多优化才能找到合适的兼容抗体对。然而，使用多克隆二抗的灵敏度增益可能使这成为开发有效检测方法必不可少的。
无论使用哪种ELISA类型，所有ELISA都以检测步骤结束，通常使用酶介导的可见颜色变化化学试剂，然后可以使用紫外-可见分光光度法进行测量。将酶偶联抗原或抗体应用于测试孔，如果存在靶标，它将结合。当酶的适当底物添加到板中时，它会导致与孔内结合的靶标量成正比的颜色变化。辣根过氧化物酶（HRP）是一种常见的偶联物，与底物3,3'，5,5'-四甲基联苯胺（TMB）合作使用，TMB在HRP的作用下变成蓝色，然后在加入硫酸溶液后变成黄色，从而终止反应。
然后可以使用酶标仪（在添加终止液后检测450 nm）确定每个孔的吸光度值，并根据分析设计进行校正和计算，例如减去平均空白孔值、平均技术重复或与标准品的比率计算。
ELISA 工作流程示例
五、ELISA检测结果分析
ELISA结果可以定量、定性或半定量。在定量分析中，使用已知标准品的连续稀释来生成标准曲线，通常是光密度（OD）与浓度的关系曲线。由此，可以计算出未知样品中靶标的精确数量。
ELISA实验中未知物的标准曲线计算和目标浓度测定示例
在定性分析中，通常仍会使用酶标仪以数值方式收集数据，但与没有标准曲线的空白和/或阴性孔进行比较，结果将被解释为阳性或阴性。
半定量分析还可以在不使用连续稀释或标准曲线的情况下收集数值数据。然而，同时包含阴性和阳性标准品（通常为高阳性和低阳性），有助于对未知样品孔与已知状态样品孔之间的水平进行相对比较。使用这些标准品监测检测重现性，可以设置一个临界值，其中超过阈值的结果被确定为阳性，低于临界值的结果被确定为阴性。
虽然在某些情况下可能需要定量分析，但在每个板上包含完整的标准曲线会占用宝贵的孔。因此，根据使用者希望从检测结果中获得的信息，存在方式的权衡。
与许多检测方法一样，从ELISA获得的结果很少可能达到100%准确，可能会出现假阳性和假阴性结果。因此，大多数测试将与敏感性和特异性的测量相关联；它们越接近100%，测试就越好。
有许多因素会影响这些值，例如：非特异性结合或交叉反应性从而带来的高背景；抗体对靶标的亲和力差次；检测条件；样品条件和复杂性。
因此，计算灵敏度和特异性值是许多ELISA检测开发中的重要步骤，尤其是在诊断环境中，以确定所获得结果的信息量和可靠性。
