脊椎动物可以产生抗体的B淋巴细胞首先作为造血干细胞出现在骨髓中，并分化为祖B细胞（pro-B）、前B细胞（pre-B）和未成熟的B淋巴细胞。未成熟的B淋巴细胞表面带有可特异性结合抗原的免疫球蛋白受体。在离开骨髓之前，未成熟的B淋巴细胞上的IgM型抗原特异性受体可用于去除与自身抗原发生反应的淋巴细胞。这个过程对自身抗原的攻击极为重要。只有对自身抗原不敏感的未成熟B淋巴细胞能够分化为成熟的B淋巴细胞，表达IgM型和IgD型免疫球蛋白。这一过程主要发生在骨髓中，脾脏和淋巴结等次级淋巴器官也有发生。当免疫细胞遇到外来抗原时，免疫反应迅速产生。首先，专业的抗原递呈细胞捕获入侵的外来抗原，并与MHC Ⅱ类分子在细胞表面结合以呈递免疫信息。然后，这些信息被传递至辅助性T淋巴细胞，辅助性T淋巴细胞被激活后选择性刺激抗原敏感的成熟B淋巴细胞，这些B淋巴细胞在其细胞表面可与同样的MHC复合物结合，这一现象也发生在抗原激活的专业抗原递呈细胞上。抗原激活后的第二个主要过程是变为记忆B淋巴细胞，记忆B淋巴细胞可以被同一抗原再次快速激活。记忆B淋巴细胞的产生与类别转换和体细胞超突变有关。同一抗原的重复刺激有助于高亲和力抗体的产生，这一过程被称为亲和力成熟。

        原始的杂交瘤技术利用日本血凝病毒（HVJ）和聚乙二醇（PEG）融合抗原致敏的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞从而产生杂交瘤细胞，存在大量不可控的非特异性融合。产生高亲和力和高特异性单克隆抗体的杂交瘤技术有两个关键点。第一点是B淋巴细胞分化成熟的免疫过程。第二点是靶向抗原致敏的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的选择性融合过程。

这篇文章介绍了基于抗原对B淋巴细胞预选的新一代杂交瘤技术，并使用电脉冲将其与骨髓瘤细胞选择性融合。

1.传统杂交瘤技术

       在杂交瘤技术出现之前，抗体主要来自免疫动物血清的多克隆抗体，这些抗体具有不均质性，可与几种表位交叉反应。使用HVJ或PEG的传统杂交瘤技术可产生具有均质性的单克隆抗体，特异性识别单一的抗原表位，融合效率较低。

图1：基于PEG和HVJ的传统杂交瘤技术。B：B淋巴细胞；M：骨髓瘤细胞；BM:杂交瘤细胞。

2，改良的杂交瘤技术

        为了改良传统杂交瘤技术，新的杂交瘤技术陆续被建立。珍珠链形式通过施加不均匀的交流电场，骨髓瘤细胞和免疫的B淋巴细胞在电极表面形成单层，并在电场脉冲下融合形成杂交瘤细胞。这一方法提高了融合效率，但仍旧存在脾细胞-脾细胞融合和瘤细胞-瘤细胞融合。此外，也无法控制所融合的B淋巴细胞是否具有特异性。

图2：基于珍珠链形式的改良杂交瘤技术

如图三所示的激光辐射模式，在显微镜下，捕获激光转移淋巴细胞使其与骨髓瘤细胞接触，接着用脉冲激光束照射淋巴细胞-骨髓瘤细胞的接触表面。这一手动操过程可以准确的控制淋巴细胞和骨髓瘤细胞之间的融合。但是耗时，也无法确定与骨髓瘤细胞融合的B淋巴细胞是否具有特异性。

图3：基于激光辐射的改良杂交瘤技术

3.新一代杂交瘤技术-靶向B细胞

       为了实现特异性B淋巴细胞与骨髓瘤细胞选择性融合，建立了脉冲电场法或B细胞靶向技术（BCT）。这一技术包括三个关键步骤。首先是利用免疫球蛋白受体对抗原致敏B淋巴细胞的预选。其次是通过生物素和亲和素使抗原选择的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞接触。最后是B淋巴细胞-骨髓瘤细胞通过电脉冲选择性融合。根据选择B淋巴细胞的结合物，已经开发了两种BCT方案，即抗原-生物素（FIG4A）或抗原-亲和素（FIG4B）。后一种情况也可使用抗原-链霉亲合素。

图4：基于BCT的新一代杂交瘤技术。Ag:抗原；Av：亲和素；B：B淋巴细胞；M:骨髓瘤细胞；BM:杂交瘤细胞；NHS-Bio：羟基琥珀酰亚胺-生物素；StAv：链霉亲合素。

      第一种方案中，抗原选择的B淋巴细胞可以通过亲和素或链霉亲合素形成B细胞-抗原-生物素-亲和素（链霉亲合素）-B细胞复合物。抗原-生物素结合物选择B淋巴细胞后，由于添加亲和素或链霉亲合素会形成B细胞-B细胞复合物，可能会导致抗原选择的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞之间融合效率降低，但可以通过在生物素化抗原中加入过量的亲和素或链霉亲合素来改善。

    当使用来自牛心脏线粒体的F₀F₁-ATPase的F₀亚基作为抗原时，融合效率超过16.5%，而通过PEG介导的方法融合效率仅为1.1-5.6%。并且，链霉亲合素具有酸性等电点（pI）,在中性pH条件下带有负电荷，因而可抑制链霉亲合素与带负电的B淋巴细胞的非特异性结合。

       为了防止形成B细胞-B细胞复合物，可以使用第二种方案中的抗原-亲和素（或抗原-链霉亲合素）复合物来选择B淋巴细胞。通过抗原-生物素或抗原-亲和素（或抗原-链霉亲合素）复合物预选得到来自抗原免疫小鼠的B淋巴细胞后，利用生物素和亲和素（或链霉亲合素）使之与骨髓瘤细胞连接。

4.BCT的应用

          根据图4B，首先使用由49个氨基酸组成的，包含三个不同的目标肽序列长肽进行免疫，然后将三种不同的肽-亲和素复合物用于预选B淋巴细胞。结果，以平均50.4%的高融合率成功产生了单克隆抗体。这是用PEG介导方法获得结果的5-40倍（仅1.8-8.2%）。此外，由BCT产生的每种单克隆抗体对相应的肽序列显示出高特异性。在长肽中未检测到与其他肽序列的交叉反应。PEG方法生成的单克隆抗体没有特异性反应，但显示出与未指定区域的交叉反应性，与BCT方法形成鲜明对比。接着，还证实了BCT对于15个氨基酸组成的短肽序列的适用性，成功获得基于BCT产生针对短肽序列的特异性单克隆抗体。

为了测试BCT对低分子量化合物的潜力，选择邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）作为抗原。成功的产生针对DEHP的新型高亲和力单克隆抗体，该抗体与其他邻苯二甲酸酯衍生物几乎没有交叉反应。克隆杂交瘤细胞后，解离常数（Kd）值介于10^-9和10^-11之间。

因此，BCT可用于有效产生针对肽和低分子量化合物的单克隆抗体。从理论上说，BCT产生的所有杂交瘤细胞都可以分泌所需的单克隆抗体。

5.体外免疫

      免疫通常必须在体内进行，并且需要几个月的时间才能完成。如果免疫可以在短期内完成，那肯定会促进单克隆抗体的迅速产生。因此本文提出体外免疫，将未免疫小鼠的脾细胞与胞壁酰二肽、IL-4、脂多糖和靶标抗原于37℃在CO₂培养箱中培养3-5天。免疫荧光分析即可检测到一些抗原选择的B淋巴细胞，并且通过荧光激活细胞分选分析还发现了IgM和IgD双阳性成熟B淋巴细胞。然而，BCT体外免疫后产生的单克隆抗体表现出相对较宽的交叉反应性。

6.多靶标技术

传统方法中一只小鼠产生针对一种抗原的单克隆抗体。如果仅使用一只小鼠产生针对多种抗原的单克隆抗体，将有助于小鼠的保护并减少产生单克隆抗体的工作量。为了实现此目标，开发了一种多靶标技术，使用对应的抗原，基于B淋巴细胞上的免疫球蛋白受体，将被多种抗原致敏的B淋巴细胞预选出来。初步结果表明，在用多种抗原免疫后，在多种致敏B淋巴细胞存在的情况下，用对应抗原进行特异性B淋巴细胞选择时，目标抗原可以特异性地选择每个B淋巴细胞。将多种抗原用于一只小鼠的免疫时，由于其他抗原的免疫刺激会发生免疫抑制，因此一只小鼠仅可使用3-5个抗原进行免疫。

图5：基于多靶标技术的新一代杂交瘤技术

7.立体特异性靶向技术

立体特异性靶向技术针对抗原三级结构，产生特异性单克隆抗体。使用表达抗原的骨髓瘤细胞来选择致敏B淋巴细胞，完整的细胞表面表达的抗原保留其三级结构，转染后的骨髓瘤细胞保持高存活力。骨髓瘤细胞-（抗原）-（免疫球蛋白受体）-B淋巴细胞复合物，通过电脉冲选择性融合。PEG也可使骨髓瘤细胞选择的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞特异性融合。当选择促甲状腺激素受体作为抗原时，针对促甲状腺激素受体的单克隆抗体能够竞争TSH上相同的结合位点。立体特异性靶向技术所产生的的杂交瘤细胞效率低于通过BCT获得的。

图6：基于立体特异性靶向技术的新一代杂交瘤技术

医用人单克隆抗体对靶抗原具有非常高的特异性，具有相对较长的半衰期，同时对人体产生的副作用较小,因而需求已急剧增加。立体特异性靶向技术可产生针对所需抗原三级结构的特异性单克隆抗体。立体特异性靶向和转基因小鼠的组合对于产生针对靶抗原的构象特异性人单克隆抗体是明确可行的。

BCT技术、多靶标技术和立体特异性靶向技术中最重要的一步就是将抗原选择的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞选择性融合。施加电脉冲时，在平行排列的电极之间会形成垂直强电场。沿电场排列的B淋巴细胞-骨髓瘤复合物可以有效融合，而在任何其他方向上的复合物都不会发生电融合。目前还没有关于细胞复合物角度的电融合效率的研究。但通过控制其方向排列，效率可以显著提高。激光，电泳，磁力和微流控，介电电泳作为驱动力可操纵细胞的排列结构。因此，在施加电场以进行细胞融合之前使用介电电泳技术可能会显著提高效率。另外，由于介电电泳操纵是基于交流电压，因此可以很容易融合到细胞系统中。

体外免疫可以使用较低水平的、体内有毒或不稳定的抗原，且该过程可在3-5天内完成。但由于免疫时间较短，B淋巴细胞的成熟程度可能不足。转基因Immorto小鼠细胞在体外的寿命较长，可以解决这一问题。

除小鼠外，还可使用其他动物物种利用杂交瘤技术产生单克隆抗体。兔子等较大的动物可能具有更大的B淋巴细胞库。免疫的兔脾细胞与含有兔转基因的小鼠骨髓瘤细胞融合时，生成的异种杂交瘤细胞非常不稳定。因此在降解之前，从异种杂交瘤细胞中分离编码目标抗体的基因并转染哺乳动物，以产生Kd值约为10^-14M，具极高亲和力的单克隆抗体。

Masahiro Tomita, Kanta Tsumoto. Hybridoma technologies for antibody production. Immunotherapy(2011)3(3).371-380.