【引言】

由于竞争性

酶联免疫吸附试验(ELISA)遵循抗原-抗体特异性反应原理，具有检测时间短、成本低、工艺简单等特点。ELISA主要分为夹心ELISA和竞争性ELISA。夹心ELISA通过第一抗体捕获系统中的抗原，然后通过标记抗体形成抗体-待测分子-抗体的夹心复合物，并向前产生免疫识别信号。而竞争性ELISA是通过目标分析物与人工抗原共同竞争结合抗体，并随着目标分析物浓度的升高而反向产生免疫应答信号。长期以来的观点是，小分子不能同时与两种亲和物兼容，并且不可能开发小分子的夹心ELISA方法。

因此，夹心

然而近年来，多位研究者建立了许多分子量小于1000 Da的夹心ELISA方法，验证了夹心ELISA适用于小分子的检测，并且有高检测灵敏度。为了开发灵敏度更高的夹心ELISA，抗原表位之间的距离应该有多大?表位之间的距离应该有多大才能不影响夹心复合体的形成效率?作者从检测方法的应用出发，将夹心法灵敏度不低于竞争法的表位之间的距离定义为，并将没有位阻而形成夹心复合物的表位之间的距离定义为。。

　　硝基呋喃酮是一种禁用抗生素，经常在水产养殖中非法使用。它在体内代谢迅速，缩氨基脲(SEM)是硝基呋喃酮的小分子(75 Da)代谢物，中国国家标准规定，动物源性食品中不能含有SEM。SEM可与邻硝基苯甲醛(NBA)进行高回收率衍生化反应。针对这种SEM- NBA衍生物的抗体可用于SEM免疫分析。在这项研究中，作者使用了几种SEM衍生物来评估两个表位之间的距离对夹心免疫测定灵敏度的影响(图1)，并以此探索小分子夹心复合物的形成规律。

　　图1夹心原理及衍生化示意图

　　【内容介绍】

第一个

作者先是使用衍生化试剂，通过不同长度的饱和碳链连接模型分子，构建了SEM - NBA -间隔臂(Cn)-生物素化合物，作为检测目标物。之后采用夹心ELISA法测定表位SEM - NBA-间隔臂-生物素之间的优势距离和最佳距离(间隔臂长度升序排列)。夹心ELISA采用两种实验方案，包被抗体均为抗SEM - NBA抗体，目标检测物为不同长度间隔臂的SEM - NBA -间隔臂(Cn)-生物素，二抗为酶标抗生物素抗体或亲和素，原理如图1。以空白+ 3 SD(n = 6)为检出限。

　　小分子夹心酶联免疫吸附试验的失败不是由其分子量直接引起的，而是由于表位之间的距离太小而引起的位阻。如果两个表位之间的距离足够大，小分子也可以被夹心结合。研究表明，两个表位之间的距离越短，所需的亲和反应时间越长，检测灵敏度越差。通过增加反应浓度或延长被测小分子的孵育时间，可以提高该限度;但灵敏度过低，培养时间过长，不利于该方法的实际应用。

　　图2不同间隔臂夹心ELISA对sem - nba -间隔臂生物素的吸光度值

蓝线

图2中的表示在双抗体夹心模式下，不同间隔臂对复合物形成的影响。当丙二醇(propanediol)作为间隔臂时，吸光度超过了检出限。此时，两个表位之间的距离为12 Å，是该模式下的优势距离。当1,6-己二醇(1,6-hexanediol)作为间隔臂时，吸光度值达到平台值，表明两种抗体之间没有位阻。在这种情况下，两个表位之间的距离为16 Å，这是该模式下的最优距离。图2中的表示在抗体-亲和素夹心模式下，不同间隔臂对复合物形成的影响。以1,3-丙二醇(1,3-propanediol)为间隔臂时，吸光度超过了检测限。此时，两个表位之间的距离为13 Å，这是该模式下的优势距离。而以1,6-己二醇(1,6-hexanediol)为间隔臂时，吸光度达到平台值。在这种情况下，两个表位之间的距离为17 Å，这是该模式下的最优距离。这些发现表明，双抗体夹心法亲和力和抗体-亲和素夹心法亲和力对表位之间的距离有相似的要求。

　　图3 SEM夹心ELISA标准曲线(n = 6)

夹心

图3为夹心ELISA SEM标准曲线。双抗体夹心和抗体-亲和素夹心的EC50值分别为11.2和7.3 pg/mL(SEM计算)，最终检测溶液的LOD分别为1.5和0.7 pg/ mL(空白+ 3SD)。与使用相同抗体建立的竞争性ELISA相比，。该方法的最大优点是预处理简单。传统的SEM竞争性ELISA需要在通风柜中进行复杂的提取和浓缩过程，以获得低LOD。然而，作者所开发的夹心ELISA只需要稀释以消除基质干扰，即可实现组织样品的LOD分别为30 ng/kg(双抗体夹心)和14 ng/kg(抗体亲和素夹心)。

　　作者以鱼和虾为实验对象，对构建的夹心酶联免疫吸附试验的准确性进行了评价。采用灵敏度较高的抗体-生物素夹心ELISA法检测样品。样品经HPLC-MS/MS(未检测出SEM)鉴定为阴性样品，在两个阴性样品中分别以30 ng/kg和100 ng/kg的剂量给药SEM。采用本研究建立的夹心ELISA法对阴性和给药样品进行检测。五个阴性样本的检测没有产生假阳性结果，表明样品中的天然生物素不会影响夹心ELISA的结果，因为干扰物质在ELISA洗板步骤中被去除。而给药样品的平均回收率为75% ~ 89%，平均相对标准偏差为13%，表明该方法可用于实际样品的检测。

　　【结论】

　　作者研究的新方法具有几个优点，包括灵敏度提高(30倍)、简单的操作过程、环保，在样品预处理过程中不需要提取、干燥或浓缩。所有硝基呋喃代谢物都含有一个肼基团;因此，从理论上讲，夹心酶联免疫吸附试验的衍生试剂和路线一般适用于其他硝基呋喃代谢物的检测。

　　原文出处linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S030881462301453X

　　指导老师：王战辉