【摘要】
在快速诊断技术中，侧流免疫层析法（LFA）因其便携性、操作简便和快速出结果的特点而备受关注。但是，LFA的主要缺点是有限的敏感性和选择性。为了解决这些问题，研究人员已经开发了多种创新策略，如样本富集、分析条件优化和信号放大。但是抗体定向问题却常常被忽略，而不适宜的定向可能会显著降低检测性能。
本文首先探讨了传统方法，比如细微的物理性调整和非特异性化学键的形成，然后重点讨论了抗体定向固定在探针表面上，旨在通过利用蛋白质间的亲和力或互补的氨基酸序列从根本上提升检测的灵敏度和选择性。本文总结了抗体定向对LFA分析性能在灵敏度、特异性、检测速度、可靠性、成本效益和稳定性方面的影响。此外，文章还介绍了对检测膜材料的最新改进，并探讨了LFA目前的局限性和未来的发展潜力。
LFA 具有多功能性，可在各种环境中应用，包括实验室、医疗中心和日常生活。COVID-19大流行期间，临床资源分配不均和医务人员短缺加剧了混乱，导致疫区扩大和死亡率上升。这凸显了对快速、中等准确度的市售诊断工具的需求。LFA提供了一种便携、负担得起且无需专业的诊断解决方案，能在半小时内提供结果，相比于需要数小时到数天的PCR检测，具有明显优势。尽管LFA存在不足，但表现出 37.7% 至 99.2% 的灵敏度和超过 92% 的选择性，超越了家庭自我诊断。然而，随着LFA的普及，对其敏感性和选择性的担忧也在增加，假阴性和假阳性结果仍然是一个问题。
图1.RT-PCR 与当前 LFA 的比较
传统提高LFA选择性和灵敏度的方法可分为内部和外部修饰，内部修饰侧重于改善 LFA 系统内的化学相互作用，例如使用基于聚合物的 LFA 通过疏水效应促进蛋白质接枝，实施 3D 生物接头，通过增加表面积来减少空间位阻和控制流体流速，以及添加额外的共轭垫以允许多层纳米颗粒 （NP） 共轭，从而增强比色信号强度。外部修饰主要针对信号或读数的表达。包括：（i） 调整金纳米颗粒 （AuNP） 的大小，（ii） 优化接头的长度，（iii） 应用电活性标签，以及 （iv） 增强视觉信号。前两种策略侧重于放大表面等离子体共振 （SPR），而后两种策略旨在改进使用电信号、化学发光、比色法或量子点的检测方法。此外，磁性可用于样品定位和预浓缩。这些修改通常优先考虑分析的进步和样品富集，相对于 PCR，LFA 的固有优势可能会受到影响，例如检测时间短、检测设计简单和样品预处理要求最低。传统方法的主要目标是提高结合效率，这是实现正确探针方向的结果。
抗体方向的修饰策略是膜工程和探针修饰。从本质上讲，固定化利用（生物）化学来最大限度地暴露有效结合位点，从而提高结合效率。无论是将探针锚定在纳米颗粒、特定分析物还是测试和控制线上，定向固定都通过最大限度地暴露结合位点来确保安全和精确的结合。在这种情况下，LFA 保持了其检测时间短、复杂性低和样品预处理要求最低的标志性特征。此外，由于捕获-分析物复合物数量的增加，实现了更高的灵敏度或选择性。虽然定向固定背后的理论看起来很简单，但实际操作具有一定复杂性。在这些方法中诱导形成的化学键的能量较弱，对实现定向固定仍有一定困难。对于固定效率较高的方法，在费用、时间和精力方面成本可能较高。将蛋白质作为助手是一把双刃剑。一方面，由于蛋白质结构域中的特异性相互作用，适当的蛋白质可以定向引导探针。另一方面，由于蛋白质具有生物活性，因此必须仔细考虑环境条件、对靶标的亲和力以及与其他官能团的交叉活性等因素。
实现高灵敏度和选择性对于实现即时诊断的概念至关重要。目前，抗体固定方法可分为两种主要类型：非共价修饰和共价修饰。无论采用何种原理，主要目标是最大限度地提高结合位点的暴露，以最大限度地提高 LFA 的灵敏度和选择性。当抗体附着在 LFA 的膜表面时，可能会出现四种类型的排列。其中，“end on”方向被认为更优越，因为它更大程度地暴露了 Fab 片段上的结合位点，从而显著提高了有效结合的可能性。因此，专注于调整抗体以实现末端定向的努力已成为一个重点。
图2.抗体附着在 LFA 的膜表面四种类型的排列
实现抗体定向的方法多种多样，其中物理吸附因其简单直观而最常用。物理吸附通过非共价相互作用，如疏水效应、氢键、静电相互作用和范德华力，利用探针、纳米颗粒和平台材料的表面特性来固定化抗体，而不显著改变分子的电子结构。然而，物理吸附形成的化学键较弱，导致抗体的固定不够有效或定向。为了实现更精确和完全的抗体固定，已经开发了多种修饰方法，可以分为探针修饰和膜修饰两大类。探针修饰可以是非共价或共价的，取决于化学键的类型。而膜修饰则涉及测试线、控制线以及试纸底物成分的修改。
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探针修饰
1.1非共价键合
在 LFA 中，通常使用两种彼此具有高亲和力的蛋白质来实现定向固定。
图3.LFA 中使用的蛋白质之间非共价键的典型类型
蛋白 A、蛋白G 和蛋白 A/G 是广泛用于固定某些免疫球蛋白的蛋白质。Sotnikov 等人开发了一种基于常规类型的高级二期 LFA。在免疫层析血清学诊断初始阶段利用金纳米颗粒与葡萄球菌免疫球蛋白结合蛋白 A 和固定在工作膜上的抗原偶联。在后续阶段，引入了一种标记的免疫球蛋白结合蛋白加强结合免疫复合物的着色。这种两步法显著减少了非特异性免疫球蛋白对检测结果的干扰。使用 SARS-CoV-2 的重组 RBD 蛋白进行测试，测试区着色强度增加了两个数量级以上，假阴性结果显著减少。LFA 的诊断敏感性从传统格式的 62.5% 提高到增强格式的 100%。在 Kim 的研究中，对使用蛋白 G 将抗体定向固定在磁珠上与使用胺基随机固定进行比较。尽管定向固定化的偶联物浓度较低，但在较高的靶标浓度下观察到更大的信号增强。这表明使用定向固定技术确实可以提高敏感性。除了直接应用蛋白质 A 和蛋白质 G 外，还可以采用交联技术。Choi 和他的团队对蛋白 G 进行了基因工程改造，使其在 C 端包含两个半胱氨酸残基。这种修饰使半胱氨酸上的巯基能够自组装到金表面上，从而大大增强了金板的荧光性能。
图4.蛋白 A 或蛋白 G 的帮助下进行抗体定向固定。（A） 蛋白 A 促进第二阶段 LFA：（i） 拟议的增强型血清诊断 LFA 方案和 （ii） 含有 0 （1）、0.003 （2）、0.01 （3）、0.03 （4）、0.1 （5） 的样品的普通（左图）和增强（右图）LFA 后的试纸照片， 0.3 （6）、1 （7）、3 （8） 和 10 （9） μg mL−1的 MAb RBD5313。（B） 以随机（左）和定向（右）方式将抗体固定在磁珠上。（C-i）半胱氨酸修饰蛋白 G 将 IgG Fc 结合结构域修饰和 IgG 固定在金表面的示意图。（C-ii） 固定在 PBS 处理的金（左）、野生型蛋白质处理（中）和半胱氨酸修饰的蛋白G 处理（右）金表面的 Cy3 标记抗体的荧光显微镜分析。
1.1.2生物素-（strept）亲和素相互作用
链霉亲和素与捕获探针预孵育可以导致链霉亲和素复合物的多方向固定，这为生物素化检测探针提供了结合位点。Nichols及其同事成功地应用这种方法检测了SARS-CoV-2。Wu的团队设计了一种基于BioAb/SA-BSA/MPA/AuNS/SPCE的免疫传感器，专门用于检测SARS-CoV-2。这项研究开发了一种基于无标记电化学阻抗谱（EIS）的免疫传感器，利用金纳米结构丝网印刷碳电极（AuNS/SPCE）来检测唾液中的SARS-CoV-2核衣壳蛋白（N蛋白）。通过使用短链3-巯基丙酸（MPA）作为接头，将链霉亲和素（SA）和牛血清白蛋白（BSA）共价键合，以控制生物素化抗N蛋白抗体（BioAb）的定向固定化。展现出更高的灵敏度、更低的检测限（LOD）和高度特异性。这表明通过使用BSA将抗体固定在各种材料上可以改进病毒检测的潜力。
图5.在生物素-亲和素相互作用的帮助下进行抗体定向固定。（A-i）通过引入生物素-亲和素化学技术开发半条带 LFA，用于检测 SARS-CoV-2。（A-ii）通过使用从 Genemedi 和 Genscript 获得的两种市售 SARS-CoV-2 核衣壳 （N） 蛋白，为半条带 LFA 生成的剂量-反应曲线。（B-i）显示基于 AuNS/SCPE 的免疫传感器制造的步骤，包括用 MPA 修饰 AuNS/SPCE、用EDC/NHS 激活、SA-BSA 的固定化、BioAb 的固定化，最后是 N 蛋白免疫反应。（B-ii）BioAb/SA-BSA/MPA/SPCEs对各种分析物的特异性性能。
为了提高定向固定化效率，利用抗体上存在的特定官能团如胺基，羧基，二硫键，和Fc 区铰链结构域中的可修饰碳水化合物部分。与物理吸附相比，共价键固定化方法具有优异的键强度，从而提高了固定化效果。
图6.调节抗体方向的共价键策略。（A） 抗体结构和功能性 Fc 和 Fab 区域。抗体和探针之间的共价键合反应，包括 （B） 羧酸-胺、（C） 二硫键裂解和 （D） 碳水化合物反应。
最常用的方法包括通过 EDC/NHS 偶联形成酰胺键。有团队通过 EDC/NHS 成功实现了抗体与 AIE 发光原 （AIEgens） 的偶联，从而能够目视检测 SARS-CoV-2 的受体结合域 （RBD） 和 N 抗原。该方法的检测限较低，低至 6.9 ng mL−1用于 RBD 蛋白和 7.2 ng mL−1对于具有高特异性的 N 蛋白。Chan 的小组使用与4,7,10-三氧杂-1,13-十三烷二胺（一种灵活的二胺-PEG接头）作为接头，将聚合物与抗体偶联，抗体可以定位与靶抗原结构域对齐，特异性结合亲和力显著增加。
图7.在胺基和羧基的帮助下改变抗体方向。（A-i）基于 AIEgen 的试纸的配置和检测机制示意图。（A-ii）0、0.001、0.01、0.1、1、10 和 20 μg mL 试纸在 365 nm 光照射下的试纸图像−1PBS 中的 RBD（左）和 N（中）蛋白。右图：与含有 1 μg mL不同抗原（AFP、HCG、CEA、CA125、HSA、S2 蛋白、RBD 蛋白、FBS、CRP 和 N 蛋白）的样品反应后，试纸在 365 nm 光照射下的图像−1).（B-i）示意图显示了在探针表面实现抗体功能化的传统方法。（B-ii）修饰二胺作为探针表面和抗体之间的接头。底部面板显示了与含有 0 或 5 ng mL 的样品反应后的试纸照片−1的 PSA 抗原。
存在于抗体铰链区的二硫键也可以促进固定。Jeong 等人通过马来酰亚胺偶联，使抗体与硅纳米颗粒的结合增加了大约 8 倍。由于实现了适当的定向，巯基固定化抗体的使用表现出卓越的特异性靶向能力。例如，使用双金偶联物开发了唾液样本中 SARS-CoV-2 刺突 1 （S1） 抗原的快速检测平台，以增强信号。在这项研究中，金标记的抗 S1 纳米抗体 （Nbs） 作为 S1 检测器偶联物，而金标记的血管紧张素转换酶 2 （ACE2） 作为 S1 捕获偶联物（图4A）。在循环阈值 （Ct ≤ 30） 的阳性样本的早期检测中，与 mAb 基试纸条相比，基于 Nbs 的LFT 试纸条表现出更高的灵敏度 （97.14%） 和特异性 （98.57%）（图 4B），为在易于收集的唾液样本中快速筛查 SARS-CoV-2 S1 抗原提供了灵敏的诊断工具。
图8.（A） 示意图说明了用于检测唾液样本中 SARS-CoV-2 S1 抗原的增强型夹心 LFA。（B） 使用 Nbs 或 mAb 的增强型 LFA 试纸条中的颜色强度与唾液样本中病毒拷贝数之间的关系。
Daniele 和 Menegatti的小组通过碳水化合物固定实现了信号放大，这种通过 Fc 碳水化合物基团的位点特异性方法降低了偶联异质性，并增加了正确定向 IgG 检测器偶联物的可能性。Lin 等人使用环状硼酸二酯与捕获抗体上的碳水化合物定向结合，用于凝集素检测，构建了一个微阵列平台。银增强图像表明，以定向方式固定的抗体微阵列产生了清晰且均匀的阵列。抗体在微阵列上的定向显著提高了检测灵敏度。与随机 NHS 化学固定化获得的检测结果相比，检测结果明显更亮，说明了抗体定向的重要性。
图9.在碳水化合物的帮助下进行抗体定向固定。（A-i）示意图显示了以量子点作为信号报告基因的侧向层析夹心免疫测定。抗体和量子点之间通过碳水化合物基团的偶联是通过氧化抗体 Fc 区的糖基化区域来实现的。（A-ii）普通 EDC 偶联和碳水化合物氧化后还原胺化对分析物的信号响应比较。（B-i）用于凝集素传感测定的基于糖纳米颗粒的定向抗体微阵列的示意图。（B-ii）通过硼酸盐形成定向固定和随机酰胺键形成制备的捕获抗体之间的检测性能比较。
除了用于抗体定向的探针修饰外，与探针相比，促进毛细管效应的膜经常被忽视。LFA 膜的结构包括硝酸纤维素膜和涂层测试/对照线，其中两种组合物也可以进行定向修饰。这类技术包括成熟的蛋白质预包被和新开发的纤维素材料。
2.1测试线和控制线的修饰
蛋白A和蛋白G不仅可以与抗体探针偶联，还能用于修饰检测线和控制线，结合位点朝外，以提高灵敏度。在实验中，使用蛋白G预包被的检测线能够有效捕获抗体复合物，并在高样品稀释下保持良好检测限。Cai 等人用蛋白 G 预包被测试线，当抗原存在时，能够定向捕获抗 rSjSAP4 抗体复合物。该设备表现出令人满意的检测限，即使在 320 倍样品稀释下，R 值仍保持在 1 以上。但在高浓度血清样品中，非特异性抗体结合可能导致结果降低。
图11.（A） 使用预包被的重组蛋白 G 修饰测试线，用于定向抗体固定。（B） 稀释液的检测限范围为 1：5至 1：40690，通过引入 Kato Katz 阳性参与者的混合血清样品。据报道，检出限为 1：20480。C：控制线;T：测试线;NC，来自非流行对照的混合血清样品，以 1：5的稀释度测试。
链霉亲和素或生物素作为捕获探针直接包被在检测线上，能有效增强LFA的性能。与传统LFA相比，这种方法提供了更长的保质期、增强的信号及识别DNA和RNA序列的能力。此外，链霉亲和素预包被的条带还可以定向固定生物素化的纳米抗体（Nbs），后者相较于传统抗体更小，降低了无定向结合的风险，同时具有更好的抗热和化学变性能力。Magez团队利用生物素化的纳米抗体开发了针对刚果锥虫的LFA，发现与链霉亲和素包被的测试线结合的性能优于直接沉积的纳米抗体。在优化分析缓冲液后，灵敏度得到了显著提高。尽管LFA在小鼠和牛的测试中表现出一定的假阴性率，研究者们提出使用带有 AuNP （Nb44–Nb44–AuNPs） 的二价捕获纳米抗体来增强亲和力和信号放大，有望克服这一局限性。
图12.（A） 针对刚果锥虫的基于 Nb 的 LFA 的设计。（B） 加标 PBS 的检测限 TcoPYK：Nb42 包被测试线 （0.88 μg ml−1，左）和生物素化 Nb42 包被的测试线 （0.22 μg ml−1，右）。（C） 加标稀释系列 TcoPYK 的幼稚牛血清的检测限：使用单价 Nb44-AuNPs（0.88 μg ml−1，左）和二价 Nb44–Nb44–AuNPs（0.11 μg ml−1，右）作为捕获抗体。
核酸的固定化通常使用生物素、链霉亲和素或蛋白A和蛋白G等方法，这些间接方法需额外的预孵育步骤，影响成本效益和时间效率。在Bruylants的研究中，使用BSA固定的p14肽适配体成功检测癌症生物标志物Mdm2，表现出比传统抗体系统更高的灵敏度和稳定性。此外，开发的自组装四面体DNA纳米结构（TDN）提高了固定探针的方向性和密度，减少了空间位阻。Zuo等人利用TDN开发的金电极平台显著提高了对PSA的检测限，归因于适当的探针间距。TDN还被用于侧向层析试纸，能够有效检测外泌体miRNA-150-5p，显示出良好的灵敏度和选择性。尽管TDN技术具有潜力，但仍需简化探针制造程序以实现真正的POC工具。
图13.（A） 基于靶向外泌体 vmicroRNA-150-5p 的 DNA 四面体包被条带的比率式 LFA 设计。（B） 应用 0、10 进行灵敏度测试−13, 10−12, 10−11, 10−10, 10−9和 10−8miR-150-5p 的 M（左）。LOD 为 0.9921，基于灵敏度测试的数据（右）得出。（C） 通过引入 miR-150-5p、单碱基错配 miR-150-5p、双碱基错配 miR-150-5p、随机 miRNA 和 miR-21 进行选择性检测（相应地是 b-f 组。组 a 为空）（左）。当用 miR-150-5p 处理时，比率装置的 T/C 比值显著升高，b 组 （右）。
2.1.4两亲性疏水素 （HFBI） 蛋白
抗体在多孔硝酸纤维素膜测试线上的生物活性对分析灵敏度至关重要。传统的喷涂方法常导致抗体随机取向和多层叠加，损失生物活性。Zhang等人采用了两亲性疏水素（HFBI）来促进PSA抗体的有序自组装，确保抗体以“立式”取向固定在测试线。该方法的检测限低至0.06 ng/mL，比传统方法提高了灵敏度，并获得了良好的校准曲线（决定系数0.965）。特异性测试显示，仅在PSA组中有显著荧光信号。HFBI修饰的LFA在150份临床血清样本中的检测结果与电化学发光免疫测定一致，验证了其准确性。
图14.（A） 传统和HFBI 修饰的 LFA 的示意图比较。（B） 用于检测 PSA 靶标的 HFBI 修饰和未修饰FICT 的 LOD（左上）。敏感性测试（左下）：通过处理 0、0.2、1、2、5 和 12 ng mL 的 PSA 靶标，目视读取 HFBI 修饰的 FICTS−1分别。选择性试验（右）：HFBI 修饰的 LFA 与不同抗原反应后。
2.2膜的改性
为了改善方向控制，已经引入了基于纤维素的 LFA。纤维素基材（例如滤纸、棉纤维和纤维素纤维）具有更高的柱床体积和更强的非特异性结合抵抗力，从而提高了灵敏度。碳水化合物结合模块 （CBM） 是在许多碳水化合物活性酶中发现的不同蛋白质片段，它们能够结合多种碳水化合物，从二糖和低聚糖到纤维素等多糖，具有高选择性和特异性。França Prazeres 的小组首先制备了一种传统的 LFA 形式，它依赖于捕获抗体在 NC 膜测试线上的随机吸附，与由 ZZ-CBM3 融合修饰的 LFA 进行比较。结果表明，当使用纤维素作为涂层时，荧光线通常更粗、更强烈，并显示出更大的像素体积。这种线粗增加归因于生物素-BSA 溶液在纤维素层上的横向扩散增强，证实了纤维素涂层有效地作为 ZZ-CBM3 融合的锚点。另一项实验比较了在 LFA 测试线上分配蛋白 A 和ZZ-CBM3 融合对 Alexa 标记抗体的捕获能力。在 NC + 纤维素条带中观察到的 ZZ-CBM3 融合强度更高，这可归因于 ZZ 结构域在融合中提供的更有利的方向。
图15.（A） 传统NC 膜与在 LFA 中涂覆 ZZ-CBM 熔融膜的比较。（B-i）NC 条带上的纤维素涂层对生成信号的荧光强度的影响。（B-ii）在 LFA 测试线上通过蛋白A 和 ZZ-CBM3 融合对 Alexa 标记抗体的捕获效率进行比较。实验在测试线上使用 NC 条带和添加纤维素层 （NC + cel） 的 NC 条带。
Kolmar 和Schwall 等人开发了单链可变片段 （scFv） 或全长抗体 （IgG） 与来自热梭菌纤维素骨架支架的 CBM3a 结构域的遗传融合。这种方法显著提高了纤维素结合载量，与使用裸 scFvs 或 IgG 的侧向层析装置相比，该方法提高了基于纤维素的侧向层析装置的灵敏度和整体性能。
图16.（A） 使用毛细管流速约为 60 s/4 cm （C60） 的纤维素纸检测 hCG 的纤维素基 LFA。使用CBM 抗 hCG scFv 或单独抗 hCG scFv 修饰测试线。（B） 用于检测血清样品中 SARS-CoV-2 特异性抗体的纤维素基 LFA，检测线涂有 CBM-抗-Fc scFv、抗 hIgG-CBM、抗 Fc scFv 或抗 hIgG 作为检测抗体。
Kim 的小组开发了一个比色 LFA 平台，用于使用双功能融合接头 CBP31-BC 进行早期 SARS-CoV-2 检测。该接头结合了纤维素结合结构和抗体结合结构域，以将抗体定向到纤维素膜上。测试区的特点是在测试线上将 CBP31-BC 与抗 SARS-CoV-2 RBD 抗体预孵育，在对照线上单独使用 CBP31-BC。将 CBP31-BC 与捕获抗体的最佳摩尔比确定为 1：20，以最大限度地减少检测抗体在金纳米颗粒上的非特异性吸附。基于 CBP31-BC 的 LFA 使用来自 SARS-CoV、MERS-CoV和 CoV-H229E 的 S1 抗原对 SARS-CoV-2 抗原表现出高度特异性。该平台的实用能力使用培养的SARS-CoV-2 样本进行评估，显示视觉敏感性和 5 × 10 的 LOD5每毫升拷贝数。此外，使用 COVID-19 患者 （n = 16） 和健康受试者 （n = 3） 的鼻咽拭子样本证实了 LFA 的性能，显示出与 RT-qPCR 结果的高度一致性。
图17.（A） 用于检测 SARS-CoV-2 的基于 CBP31-BC 的 LFA 示意图。（B）SARS-CoV-2 RBD、SARS-CoV S1、MERS-CoV S1 和 CoV-H229E S1 抗原的 LFIA 标准化测试线强度，虚线表示无样品。（C） 各种培养的 SARS-CoV-2 浓度的 LFA 试纸的摄影图像和归一化测试线强度，黑色虚线表示临界值（3 个空白样品的平均值 + 3 个标准差）。（D） 使用COVID-19 患者的鼻咽拭子样本与 PCR 结果的 LFA 性能比较。
但是在以上方法中仍然存在一些问题，例如蛋白质之间交叉反应性引起的定向固定化减少，生物识别蛋白结构域可能与其他抗体片段结合或与非靶标分析物反应，纤维素膜上荧光在测试线和对照线上的扩散等等，这些问题仍有待解决。
2.2.2纤维素纳米纤维改性生产线
近年来，在 LFA 中添加纤维素纳米纤维 （CNF） 层已成为一种旨在提高灵敏度的成熟技术。CNF 具有较小的孔径，可增强孔隙率、表面积和暴露的羟基数量，间接提高了灵敏度。然而，这种方法主要依赖于物理吸附，与 CBM 融合策略相比，物理吸附对抗体固定的效果较差。此外，CNF 产生的致密表面会阻碍样品迁移，从而降低重现性。Merkoçi 的小组发现，CNF 凝胶增加了纸张表面附近抗体的密度，从而通过在阳性样品上保留更多报告探针来增强信号。CNF 用于穿透硝酸纤维素纸的孔隙，仅减小测试区域的孔径，增加了测试线区域中选择性连接的金纳米颗粒的密度，并将灵敏度平均提高了 36.6%。这种改性简单、经济高效，并且可以轻松应用于任何类型的 LFA 试纸条，使其适用于即时应用。
图18. (A） 未改性的阳性测试线（上图）和分配纤维素纳米纤维改性的阳性测试线的示意图（下图）。Merkoçi 教授通过引入纤维素纳米纤维的 LFA。（B） 在测试线上应用和不应用 CNF 的LFA 的摄影图像（上图），HIgG 为 0、0.01、0.05、0.10、0.25、0.50、0.75 和 1.00 μg ml−1.条形图（下图）用于比较信号增强的百分比。
【小结】
在侧向流检测（LFA）中提升灵敏度和选择性至关重要，重点是抗体定向固定。包括物理调整、共价键形成、非共价键形成、纤维素基膜和纤维素纳米纤维涂层。传统方法（如物理调整和共价键形成）存在交互作用弱和操作复杂的问题，而非共价键形成虽具有生化特异性，但面临蛋白质交叉反应性等困难。较新的CBM主导的生物识别方法也存在类似问题。此外，纤维素涂层能增强信号强度，但仍存在线路扩散和无方向固定的挑战。
除了讨论的常规和新型固定技术外，将捕获探针连接、存放或涂覆到 T/C 线上的方法也经常被忽视。本文旨在解决和改进喷涂过程中导致的随机固定，如果检测线本身在其组合中没有正确定向，则后续捕获和识别探针层也将缺乏正确的方向。总之，尽管迄今为止开发了许多技术，但没有一项技术完全达到理想的 POC 标准。LFA 在灵敏度和选择性方面仍有很大的改进空间。此外，成本和全球可用性是减轻经济和人员负担需要关注的关键因素。因此，化学工程、聚变技术和生物分子探索方面的进步是需要进一步努力和研究的领域。
Lu Z Y, Chan Y H. The importance of antibody orientation for enhancing sensitivity and selectivity in lateral flow immunoassays[J]. Sensors & Diagnostics, 2024.
原文链接：https://doi.org/10.1039/D4SD00206G
