内容简介：

　　受到大分子(例如蛋白质)组装成新功能单元的能力以及工程调节的纳米材料的卓越光学性能的启发，羊抗鼠免疫球蛋白(GAMI)作为与金锰氧化物整合的“crosslinker”(Au-MnOx)组装“signal tracers (STs)-crosslinker-antibody (mAb)”，以提高mAb利用效率。值得注意的是，“信号示踪剂-交联剂-抗体”提高了约13.33倍抗体利用效率，完美解决了竞争型侧流免疫层析(LFIA)中有限灵敏度和强信号之间的矛盾。Au-MnOx的黑色和粗糙结构提供了更高的比色亮度(约为AuNPs的2倍)和更强的mAb偶联效率(高达92.47%)，这在功能组装的前提下进一步提高了灵敏度，以强化竞争性免疫反应。此外，金锰氧化物合成简单方便(室温下约13分钟)甚至可以与直接购买的商业产品相媲美，这表明使用Au-MnOx无疑提高了成本效益。最后，基于Au-MnOx-GAMI-mAb的LFIA通过提高mAb利用效率，并以经济高效的方式增强免疫竞争反应，表现出高灵敏度(LOD：0.063 ng mL−1，用于克仑特罗(CLE)监测)，为POCT免疫测定提供了一条参考途径。

　　主要内容

Au-MnOx的合成与表征

　　首先使用不同体积的MnCl2通过一步氧化还原反应制备不同的Au-MnOx。在相同条件下偶联抗体，然后表征了不同体积MnCl2合成的Au-MnOx所对应的T线强度，结果显示T线在100 μL MnCl2时达到最高强度。之后测试了不同体积MnCl2合成的Au-MnOx的Zeta电位，综合考虑T线强度和Zeta电位，最终选择100 μL MnCl2合成Au-MnOx。之后通过TEM拍摄，(能量色散X射线光谱学)EDS，XRD，XPS等表征手段证明了Au-MnOx材料的合成。

　　图1：Au-MnOx的合成与表征

Au-MnOx作为LFIA的信号示踪剂的优越性

　　通过在NC膜上喷涂不同浓度的AuNPs和Au-MnOx来评估二者的比色光学性能。结果表明，Au-MnOx在每个浓度梯度下表现显著的咖啡环效应，这可能是AuNPs和Au-MnOx的比色差异显著的原因之一。综合来讲，所提出的Au-MnOx的平均比色信号亮度是AuNPs的2.00倍±0.12倍。考虑到在相同浓度下更高的比色亮度无疑会减少免疫探针的数量，并最终提高竞争型免疫分析的灵敏度，这表明Au-MnOx凭借优越的光学性能拥有巨大的潜力。之后又评估了Au-MnOx和AuNPs与抗体的偶联模式及偶联效率。Au-MnOx和AuNPs都可以通过抗体简单混合实现偶联。另一方面，通过icELISA统计了Au-MnOx和AuNPs与抗体的偶联效率，与AuNPs作为信号示踪剂比较，所提出的Au-MnOx在最佳免疫探针制备条件下表现出更高的偶联效率(77.09至85.11%)，这表明抗体的浪费更少，成本效益更高。且Au-MnOx不管在合成温度和总合成时间上都表现了突出的优越性。

　　图2：Au-MnOx作为LFIA系统中信号示踪剂的优势

条件优化及灵敏度增强机理研究

　　对AuNPs-AbCLE, Au-MnOx-AbCLE, and Au-MnOx-GAMI-AbCLE的Au-MnOx的浓度，K2CO3的体积，GAMI的体积，免疫探针体积等进行了优化。图3c-d中的SEM图像清楚地显示了大量Au-MnOx的存在，由于AuNPs的粒径较小(约20 nm)，图3b中的SEM图像与阳性结果几乎一致。与小粒径信号示踪剂相比，大尺寸的信号示踪剂通常需要更少的免疫探针来产生相同的信号值，这意味着需要更少的抗体，从而最终提高灵敏度。此外，单个mAb可以同时与多个GAMI结合，形成基于间接探针的免疫网络(Au-MnOx-GAMI-AbCLE)，这意味着获得相似信号强度所需的抗体更少(方案1)。从图3c(基于Au-MnOx的LFIA)和图3d(基于Au-MnOx-GAMI的LFIA)可以看出，基于Au-MnOx的免疫探针相对分散，而基于Au-MnOx-GAMI的免疫探针相对聚集。基于GAMI的Au-MnOx免疫探针相对聚集在T线区(用黄色圆圈标记)，这可能是因为在基于Au-MnOx-GAMI的免疫探针中，几个GAMI functional Au-MnOx通过一个抗体结合在一起。

　　图3：灵敏度增强机制

基于Au-MnOx-GAMI的LFIA分析性能

　　作为评价LFIA生物传感器分析性能的首要评价指标，获得了视觉检测限(vLOD)、截止值(COV)和计算检测限(cLOD)，证明了基于Au-MnOx-GAMI的LFIA分析性能有所提高。结果如下图所示。

　　图4：Au-MnOx-GAMI-LFIA的分析性能

基于LFIA的CLE分析技术的性能评估

　　通过比较不同批次的试纸条和免疫探针的T线强度来测试免疫测定方法的重现性。结果显示，多个批次的T线信号强度大致相等，变异系数(CV)为10.32%。之后使用基于Au-MnOx-GAMI的LFIA检测了猪肉和牛肉样品，实际样品5倍稀释即可消除基质干扰。

　　图5：基于Au-MnOx-GAMI的LFIA的性能

　　结论

　　作者描述了一种“交联剂”辅助的“STs-GAMI-mAb”组装策略，用于有效提高抗体利用效率并增强LFIA系统中的竞争性免疫反应。基于Au-MnOx-GAMI的LFIA在检测克伦特罗时的cLOD为0.063 ng mL-1(与AuNPs-LFIA相比提高了约9.37倍)，之后又验证了Au-MnOx-GAMI-LFIA在猪肉和牛肉样品中的实用性，为分析化学支持的免疫测定领域提供了有力的参考。

　　原文出处

　　Liu, S.; Shu, R.; Zhang, M.; Zhao, C.; Wang, K.; Zhang, J.; Sun, J.; Dou, L.; Zhang, D.; Wang, J. Goat Anti-Mouse Immunoglobulin as “Crosslinker” Assisted Signal Tracer Assemble with Intensive Antibody Utilization Efficiency for Sensitive Paper-Based Strip Nanobiosensors.Int. J. Biol. Macromol.2023,258(Pt 2), 128923.

　　指导老师：王战辉