【摘要】

　　免疫分析涉及许多可与抗体结合但具有不同亲和力的结构相似的化合物。免疫分析的一个重要特征是可以检测化合物的交叉反应性，根据交叉反应性的不同可分为高选择性(对目标化合物特异性强)和低选择性(对大量类似化合物都产生反应)。目前的研究表明，交叉反应性不是抗体的固有特征，但对于相同抗体采用不同竞争性免疫分析方法，其交叉反应性可能有所不同。如方法中使用敏感的标记物、低浓度抗体和修饰(竞争)抗原，则其具有较低的交叉反应性，即更具特异性。通过对磺胺类和氟喹诺酮类的酶免疫测定和荧光偏振免疫测定的数学建模和试验比较，证实了这一观点，使用较低浓度的试剂可将交叉反应性降低五倍。此外，通过改变各免疫反应物浓度的比率以及抗原抗体反应的动力学或平衡模式，即使在相同的测定方法中，交叉反应性也会发生变化。本研究证明了在不使用新的抗原抗体的情况下，也可以对免疫分析的特异性进行有效调节。

　　【背景】

　　用免疫技术评估化学相似物的检测，交叉反应性 (CR) 是最常用的参数。在竞争性免疫分析方法中，对于最大测量精度，交叉反应性通常是指使检测信号降低50% 的浓度比率：

       IC交叉反应性(CR) =(目标分析物)/(被测交叉反应物)× 100%

　　迄今为止，文献中已经报道了众多影响免疫分析的选择性的方法。最常见的一种方法是设计抗原，选择抗原最优结构，以产生针对抗原表位的特异性抗体。当前已开发出一些预测免疫原结构的理论工具，如免疫复合物的三维建模和定量构效关系分析 (QSAR)，但所建立的模型往往只涉及某类化合物，无法应用到其他类别。另一种改变免疫分析选择性的方法是突变修饰，包括对抗体的抗原结合位点进行靶向遗传设计。然而，这些工作需要耗费大量的时间和资源，目前仅有一小部分成功开发。作者注意到，多克隆抗体中低亲和力和高亲和力的组分对免疫复合物检测的影响随着分析物含量的变化而不同。基于这一原因，作者添加少量交叉反应分析物来阻断抗体中不良的高亲和力组分。在影响交叉反应性的其他因素中，反应介质的组成值得关注，pH值或其他测定条件对其选择性有一定影响。例如，不同浓度的尿素可以改变不同检测方法的交叉反应性。

　　本文表明，交叉反应性不是仅由免疫试剂的固定参数确定，还受分析条件的影响。其中，使用不同免疫标记物及其标记方法、不同浓度的免疫试剂、不同的免疫反应时间，都会对交叉反应性产生一定影响。在本研究中，对上述方法的预期效果进行了数学建模，并用两种免疫分析方法进行了试验验证。该数学模型使用了竞争性免疫分析方法，重点关注抗原亲和力差异，而不考虑非靶标干扰。得到的理论表明了该方法的通用性和应用于不同化合物的前景。试验验证了理论假设和结论的正确性。试验以磺胺类 (SAs) 和氟喹诺酮类中数十种结构相似的化合物为代表，采用荧光偏振免疫测定法 (FPIA) 和酶联免疫吸附测定法 (ELISA) 两种分析方法进行检测。

　　【研究内容】

　　1.竞争免疫分析模型

　　在竞争性免疫分析反应体系中，三种化合物相互作用：抗体(Ab)、测试样品中的未标记抗原(Ag) 以及修饰的竞争抗原(Ag*) ，形成AbAg和AbAg*两种类型的复合物。标记信号反映AbAg*的含量。ELISA中，Ag*是固定在固相上的抗原，标记信号反映AbAg*复合物的形成。在竞争期间或随后阶段直接引入可检测标记物，会影响信号强度，但不会影响其浓度依赖性。

　　因此，在描述竞争性免疫分析时，应考虑以下化学过程：

　　所有试剂浓度的变化率由微分方程组描述：

　　其中kai和kdi分别表示结合和解离的动力学常数。

　　在平衡模式下进行分析时(浓度变化率为零)，微分方程(3)-(5)方程组变为代数方程组：

反应物的浓度也与质量守恒定律的方程式相关：

AbAg和AbAg*复合物的平衡解离常数分别表示为Kd1和Kd2：

式(8)-(12)的复式完全描述了平衡竞争系统，并推导出每个组分平衡浓度的三次方程。以游离抗体浓度为例，三次方程为：

　　三角变换提供了该方程的解：

　　利用该解，可以计算出检测到的复合物[AbAg*]的浓度：

　　式(15)描述了测定方法的校准曲线。将初始浓度和相互作用参数的不同值代入该方程，可以研究这些因素对校准曲线位置和振幅的影响。使用式(15)可以估计结构相似的分析物在不同竞争免疫分析条件下CR的变化。

　　2.反应参数对IC50值的影响

　　图1显示了两种标记抗原初始浓度Kd1值变化的理论校准曲线。校准曲线的位置以及相应的IC50值都取决于结合常数和所用试剂的浓度。

　　图1 在抗体-未标记抗原复合物解离平衡常数的不同值下，平衡竞争免疫分析的理论校准依赖性。式(15)的参数如边栏所示。(a) 显示出 [Ag*]0=20nM时常数Kd1从0.1到10nM的变化;(b) 显示出 [Ag*]0=2nM时Kd1常数的相同方差

　　通过同时改变几个测定参数，可以调整校准曲线的参数，以达到所需的信号强度和IC50值。因此，图2显示了标记抗原和抗体的初始浓度对校准曲线形状和位置的联合作用。信号强度由参数[Ab]0和[Ag*]0中较小者决定。这两个参数以三种方式影响IC50：(i) 抗体浓度降低会使IC50值降低;(ii) 抗体过量时，[Ag*]0降低导致信号变化幅度降低，IC50值增加;(iii) 缺乏抗体时，[Ag*]0降低，导致信号变化幅度以及IC50值降低。通过降低[Ab]0和[Ag*]0的浓度，可以实现IC50值的降低，以达到检测下限。

　　图2在标记抗原和抗体初始浓度的不同值下，平衡竞争免疫分析的理论校准依赖性。

　　3.CR值对分析方法的理论依赖

　　用相同浓度的分析试剂测定几种结构相似的化合物时，交叉反应性由这些化合物与抗体相互作用的常数确定。图3显示了三种模型分析物 (I、II和III) 的理论校准曲线，其免疫复合物的平衡解离常数分别为0.1、1和10nM。计算三种选定浓度的分析反应物曲线：测定 (a) [Ab]0=1nM，[Ag*]0=1nM;(b) [Ab]0=10 nM，[Ag*]0=1nM;(c) [Ab]0=10nM，[Ag*]0=10 nM。

　　图3三种模型 结构相似化合物的平衡竞争免疫分析的理论校准依赖性(I、II和III;各子图中分别为黑色、红色和蓝色曲线)，以及使用浓度不同的三种分析反应物测定：(a)[Ab]0=1nM，[Ag*]0=1nm;(b)[Ab]0=10nM，[Ag*]0=1nM;(c)[Ab]0=10nM，[Ag*]0=10nm。

　　利用曲线计算的IC50值整合在表1中。交叉反应性可以根据化合物I、II和III IC50值的比率来量化，数据证实了IC50值随分析反应物浓度的变化。交叉反应性不是抗体本身或竞争物的固有特征，而是受特定测定方法及其条件的影响。因此，不同分析方法中使用相同抗原-抗体对测定结构相似的化合物，会得到不同的交叉反应性范围。

　　表1图3中校准依赖性的IC50值 (nM)

　　获得的数据表明，交叉反应性既取决于反应物浓度的绝对值，也取决于反应物之间的比率。

　　在抗体和标记/固定抗原浓度相等的情况下，它们的浓度越高，交叉反应性就越高。[Ab]0= [Ag*]0= 1 nM时，Kd= 0.1和10 nM的抗原，IC50值相差近8倍(图3a，表1)，而[Ab]0和[Ag*]0高10倍时，相同抗原的IC50值相差2.7倍(图3c，表1)。试剂的配比对交叉反应的影响更大。在[Ag*]0和[Ab]0浓度分别为1和10 nM时，Kd为0.1和10 nM的抗原，IC50值仅相差1.5倍(图3b，表1)。因此，CR值的变化约为5倍。使用近似相等浓度的抗体和标记/固定抗原可以使分析最具选择性。在这种情况下，应使用尽可能低浓度的试剂。所用浓度的绝对值由标记物的最小可检测浓度决定。

　　4.模型的试验验证

　　为了试验证实所建立的理论，作者对一组结构相似的磺胺类化合物进行了免疫化学测定。用两种平衡竞争免疫分析法(ELISA和FPIA)检测了7种化合物。对这两种免疫分析方法进行了初步条件优化，以实现对目标分析物检测最高的灵敏度和可接受的信号幅度。试剂的比例选择如下：ELISA板上固定的半抗原蛋白浓度为76 nM，特异性抗体浓度为0.3 nM;FPIA中，SA-(荧光素衍生物)偶联物浓度为0.16 nM，特异性抗体浓度为0.2 nM。两种分析中，免疫反应的时间均相FPIA为5分钟，ELISA为1小时。

　　两种检测方法中所选择的抗体浓度近似，而修饰半抗原的浓度在数量级上有所不同，并且与FPIA相比，ELISA的抗体浓度明显更高，用于包被的半抗原-蛋白质偶联物的浓度是FPIA中SA-(荧光素衍生物)偶联物浓度的475倍。根据现有概念，固定在酶标板上超过90%的蛋白质可能失去活性，即ELISA中修饰半抗原(所提出的模型中的Ag*)浓度比FPIA高几倍。这意味着ELISA比FPIA具有更强的交叉反应性。

　　采用两种方法测定SAs的结果整合至表2中，证实了模型的预测：对于磺胺二甲氧嘧啶，ELISA的交叉反应性超过FPIA高达8.5倍。因此，证实了免疫分析的交叉反应性不仅取决于所使用抗体的性质，还取决于分析方法的特定参数。

　　表2在FPIA和ELISA技术中，磺胺及其相对于磺胺氯吡啶的IC50和CR值

　　交叉反应性也可以通过调节同一种分析方法中试剂的浓度和比例来改变。如表3所示，使用FPIA方法测定四种磺胺类化合物的过程中，随着抗体和标记半抗原浓度增加5倍，交叉反应性从2倍(对于磺胺嘧啶)增加到9.5倍(对于磺胺二甲氧嘧啶)。

　　表3测定FPIA校准曲线的IC50值和磺胺类药物在不同浓度抗体和标记半抗原下的交叉反应性。A— SA-(荧光素衍生物)偶联物浓度= 0.16 nM，特异性抗体浓度= 0.2 nM。B— SA-(荧光素衍生物)偶联物浓度= 0.8 nM，特异性抗体浓度= 1 nM。

　　对于非平衡条件，交叉反应性也取决于免疫反应的持续时间。对于均相分析 (FPIA) ，反应可以更快地达到平衡，但试剂在ELISA中的孵育时间 (1 h) 几乎比FPIA (10 min) 久一个数量级。在动力学关联常数为1061/(M * s)，试剂浓度为1 nM时，反应在1 h内可接近平衡态的95%，可以认为是平衡态，但在较低的关联常数下，在ELISA反应时间 (1 h) 下是非平衡态。

　　为了研究动力学参数对免疫分析特异性的影响，作者使用数值方法求解反应的动力学方程，并开发了COPASI软件。得到的理论校准曲线表明，当接近平衡时，具有不同结合常数的分析物在检测时灵敏度的差异增大。由表4可以看出，在反应时间为600 s时，动力学关联常数为106和107M−1s−1的分析物，其IC50值相差1.5倍，而反应时间为3600 s时，相同分析物的IC50值相差6.4倍。因此，对于非平衡反应，交叉反应性也取决于测定时间。为了获得广泛的特异性，检测时竞争反应阶段的时间应该缩短。

　　表4不同免疫反应时间(t)和不同动力学关联常数(ka)的非平衡竞争试验理论校准曲线的IC50值。抗原衍生物[Ag*]0的浓度为0.16 nM，特异性抗体[Ab]0的浓度为0.2 nM，所有动力学解离常数kd为0.0001 /s，与修饰抗原的结合常数ka2为107M−1s−1。

　　为了验证上述理论假设，作者采用ELISA方法对三种氟喹诺酮类抗菌药物(克林沙星、莫西沙星和恩诺沙星)进行检测。表5总结了不同免疫反应时间下测定的特异性参数。结果如预期，将分析物与抗体孵育1h的试验在IC50值和交叉反应上的差异比孵育7mins的试验大几倍。克林沙星和恩诺沙星的CR值在孵育7mins时相差4.6倍，在孵育1 h时相差50倍(比值增加了11倍)。

　　表5氟喹诺酮类药物在不同免疫竞争反应时间下测定的试验校准曲线的交叉反应性和IC50值

　　5.本研究结果在生物传感器上的应用前景

　　本研究得到的结果表明，基于免疫或其他生物受体识别的分析，其交叉反应性可以在不需要新的免疫试剂/生物受体的情况下改变。改变反应性的有效方法包括：(1)将标记物更换为在较高或较低浓度时检测的标记物;(2)改变待测分析物受体分子与修饰竞争物的浓度比(上述模型中[Ab]0和[Ag*]0)。这两种方法都可以在竞争性生物传感器系统中实现。酶、纳米颗粒和其他结构常用作生物传感器中的标记物。标记物产生的光学、电化学、测温、压电或磁信号反映了与修饰分析物的受体分子和测试样品中的分析物结合后的竞争结果。

　　一般来说，可以对方法进行以下优化：

　　如果需要免疫传感器具有窄谱选择性，即降低目标分析物的结构类似物的CR，则需要降低抗体和修饰的竞争抗原的浓度，并将它们的摩尔比改为1:1，且选择灵敏度更高的标记物，如具有较高比活性的酶，更强吸收的荧光标记物，或更有效的电信号放大器。

　　如果需要免疫传感器具有广谱选择性，即增加所用抗体识别的结构相似化合物的CR，则需要采取相反的策略——增加抗体和修饰的竞争抗原的浓度，并采用非等摩尔比例。在这种条件下，免疫传感器分析可以通过使用相同的信号测定方法或减少信号产生的持续时间来实现。增加CR可能会使免疫传感器的灵敏度降低。

　　【结论】

　　迄今为止，文献中已经报道了许多调节免疫分析交叉反应性的方法。本研究建立了调节免疫分析交叉反应率的方法，不需要额外试剂、样品修饰和其他复杂的操作。待测样品中如果存在不同亲和力、结构相似的化合物，基于免疫分析信号积分(形成的免疫复合物的总量)得出的有毒污染物超过允许浓度的结论与假阳性和假阴性结果的显著风险相关，这取决于检测到的不同化合物的比例。从一种分析方法转换为另一种分析方法，可以最大限度地减少低亲和力现象(降低交叉反应性)，或者使检测到的总信号更接近分析物浓度的真实总和(增加交叉反应性)。同时，考虑到近年来对多种免疫分析替代标记物的研究，可以通过替换标记物来解决使用其他浓度试剂的问题。另一种基于免疫反应物浓度变化和/或从动力学或平衡模式转移的方法可以在不改变所用反应物的情况下实现。本文提出的方法可应用于不同的分析物，在不改变抗体的抗原结合位点的结构而对特异性产生影响的情况下，所提出的方法可以满足医学和兽医诊断、食品和饲料控制、公共安全保障以及自然资源监测等应用的需求。

原文来源：

Sotnikov D V, Zherdev A V, Zvereva E A, et al. Changing cross-reactivity for different immunoassays using the same antibodies: Theoretical description and experimental confirmation[J]. Applied Sciences, 2021, 11(14): 6581.

原文链接：

https://doi.org/10.3390/app11146581

指导教师：

王战辉