【引言】

　　食品或饲料中的霉菌毒素污染对人类和动物健康构成了严重威胁，造成了严重的经济后果。在真菌毒素中，黄曲霉毒素是人类和动物健康中最引人关注的问题。事实上，黄曲霉毒素被认为已知致突变和致癌作用最强的物质之一。全球一些国家和国际当局为控制黄曲霉毒素以及其他主要真菌毒素制定了严格的监管标准，以限制这些毒素的摄入。

　　虽然色谱技术，例如高效液相色谱(HPLC)与荧光检测或质谱相结合，可以提供真菌毒素的准确鉴定。然而，因霉菌毒素暴露、监测工具资源匮乏而真正有健康负担的广大发展中国家却缺乏一种简单、廉价的检测方法。为满足一系列分析要求，基于竞争性免疫原理测定黄曲霉毒素的大量检测方法已经开发出来。然而，与竞争性免疫分析相比，非竞争性免疫测定法灵敏度更高、动态范围更宽、精度更高、孵育时间更短，因此将是检测微量小分子的理想方法。

　　抗体工程领域的巨大进步带来了非常规抗体结合物的发现，使得小分子的非竞争性分析得以发展。作者基于抗免疫复合物(anti-IC)抗体其体积小的优点来解决小分子夹心法的空间位阻问题，同时通过噬菌体展示技术可控地、有目的地制备抗免疫复合物抗体。

　　【内容介绍】

　　作者的实验思路为：首先制备抗抗原抗体复合物(IC：immunocomplex)结合物(scFv- AP)，它们由抗IC的scFv与细菌碱性磷酸酶(AP)融合组成。作者从合成单价scFv文库中找出抗IC抗体序列，通过噬菌体展示技术制备了与细菌碱性磷酸酶融合的单个scFv结合物。其次使用抗AFB1抗体和固定在磁珠上的AFB1作为靶标物开始连续筛选。作者首先将抗IC结合物先加入到抗AFB1和非特异性可溶性小鼠IgG中来剔除非特异性结合的抗IC结合物。之后将生物素化的抗AFB1抗体固定在链霉亲和素包被的磁珠表面，并用AFB1饱和，来筛选可以结合靶标的抗IC结合物(图1)。在第三轮中，将抗AFB1直接偶联到同样被AFB1饱和的环氧涂层磁珠上，来避免结合物富集于链霉亲和素或生物素。作者共筛选了320个抗IC结合物，在测试的结合物中，只有18种结合物具有特异性。从这些序列中，鉴定出12个独特的DNA序列，克隆4H2在试验中表现出最高的信号与背景比(存在或不存在AFB1)，即最优秀的检测性能。

　　图1筛选示意图

　　大规模生产、纯化4H2抗IC结合物后，作者用不同黄曲霉毒素(AFB1,AFB2, AFG1, AFG2, AFM1)对所鉴定的抗IC结合物进行性能测试，研究其特异性。数据表明其与黄曲霉毒素B2和G1具有显著的交叉反应性，可用于接下来的免疫测定。作者将生物素化的抗AFB1抗体固定在链霉亲和素包被的微孔板上，抗AFB1抗体与目标分析物AFB1形成的免疫复合物被抗IC结合物识别，该结合物进一步被放射铕元素标记的抗AP抗体识别。实验试剂共同孵育，冲洗后，加入铕荧光增强剂(EFI)溶液后测量时间分辨荧光信号(图2)。

　　图2实验方法示意图

　　作者优化了两种免疫复合物中参与的抗体的量，虽然较高的抗体浓度增加了检测绝对信号，但EC50值的检测灵敏度并没有随着抗体浓度的增加而进一步提高。反而较低的抗体浓度可以提供更好的检测限，因为没有AFB1时的背景信号和标准偏差较低。此外，作者还考察了孵育时间对检测性能的影响。随着孵育时间的增加，绝对荧光信号有一定程度的增加。然而，较长的孵育时间并没有显著提高检测灵敏度，不同孵育时间获得的EC50值相似。

　　最终，测量的时间分辨荧光信号用空白信号+ 3 ×空白的标准偏差计算所得，该试验灵敏度为70 pg mL-1(0.22 nM)。考虑到实验分析样品提取时使用的10倍稀释系数，该LOD对应于食品样品中的黄曲霉毒素含量为3.5µg kg-1(图3)。现行的欧盟委员会法规对黄曲霉毒素的总量根据所涉及的食品的不同而变化，从4到10µg kg-1。这种新型免疫分析法的灵敏度与以前报道的黄曲霉毒素免疫分析法相当，但作者的方法有简单快速的分析优势。

　　图3克隆4H2一步检测标准曲线。测量的时间分辨荧光信号用三个重复的平均值±标准差表示。EC50值由四参数logistic拟合确定，检出限(LOD)计算为空白信号+ 3 ×空白标准差。

　　作者对非竞争性抗IC免疫测定法对实际样品基质的适用性通过加标食品样品得到了验证。用高效液相色谱法对同一加标样品进行验证分析，通过测定加标玉米、水稻和榛子样品中AFB1的浓度来评价该方法的性能。回收率为83% ~ 129%，相对标准偏差(RSD)为1 ~ 4%，证明了非竞争性免疫分析法在样品分析中的适用性。

　　【结论】

　　最终，作者证明了噬菌体展示抗体文库技术在开发针对困难靶标(如免疫复合物)的结合物方面的有效性。在抗IC抗体和单克隆捕获抗体的基础上，利用铕标记的二抗建立了一种非竞争性一步免疫测定方法。该方法具有良好的分析性能，且简便而使用成本低廉，为黄曲霉毒素筛选提供了一种实用的方法，并证明了一步非竞争性免疫测定法分析小分子污染物的潜力。

　　原文出处linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0308814622012493

　　指导老师：王战辉
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