【摘要】

　　金黄色葡萄球菌(S. aureus)是对公众健康最普遍的威胁之一。具有高灵敏度的快速检测和有针对性的杀伤对于遏制其传播至关重要。本文中，构建了一种含金属的纳米复合材料，由双金属纳米颗粒和金属有机框架(Au/Ir@Cu/Zn-MOF)构成。在与抗-S. aureus抗体(Ab)结合时，这种纳米复合材料(Ab-Au/Ir@Cu/Zn-MOF)具有双重功能，即作为侧流免疫测定中的报告探针和高效抗菌试剂。得益于Cu/Zn-MOF对Au/Ir纳米颗粒(nanoparticles，NPs)的富集，基于Au/Ir@Cu/Zn-MOF的侧流免疫测定传感器显示出103CFU/mL的视觉检测极限，其灵敏度是基于Au/Ir的传感器的100倍。此外，Ab-Au/Ir@Cu/Zn-MOF探针具有协同的光热和化学动力学杀菌作用，特异性靶向S. aureus。在H2O2(0.4 mM)和808 nm近红外辐射(1 W/cm2，5 min)的共同处理下，在纳米复合材料浓度低至6.25 μg/mL时，实现了对5×105-106CFU/mLS. aureus的完全灭菌。优异的抗菌效果归因于Ab-Au/Ir@Cu/Zn-MOF探针的三重特性：(1)增强了促进活性氧生成的多酶模拟活性，(2)高光热活性(效率为53.70%)，以及(3)通过抗体涂层靶向细菌的能力。通过改变抗体，这种纳米复合材料可以针对广泛的细菌种类进行定制，用于检测和精确的抗菌治疗。

【引言】

　　传统的基于金纳米颗粒(Au NPs)的侧流免疫分析(LIFA)作为传感材料的灵敏度不令人满意。例如，预包装食品(乳制品、肉制品、冷冻饮料等)中S. aureus的最高安全限量103CFU/mL(GB 29921-2021)，对于使用Au NPs的S. aureus的视觉LFIA，检测限(LOD)约为106CFU/mL，不足以进行食品安全监管。近年来，双金属NPs由于其模拟酶的活性和突出的光学性质，成为LFIA中备受追捧的信号探针。例如，我们小组创建了基于Au@Ru双金属纳米复合材料的LIFA用于快速灵敏地检测鼠伤寒沙门氏菌，LOD为9.8×104CFU/ml。R. Zhang等人(2021)建立了双拉曼分子标记的Au@Ag核壳纳米颗粒用于快速、超灵敏和定量地检测粪便中的轮状病毒。然而，据我们所知，很少有基于双金属纳米粒子的LFIA用于检测金黄色葡萄球菌的相关研究报告。

　　为了控制细菌污染和细菌感染，应在识别出存在的细菌后立即进行有效的杀灭和治疗。为了解决抗生素耐药性问题，已经开发了多种新兴的抗菌疗法，如基于局部温度升高的光热疗法(PTT)、基于模拟酶活性产生活性氧(ROS)的化学动力学疗法(CDT)，通过光催化产生ROS的光动力疗法(PDT)等。这些策略可以单独用作单模抗菌策略，另一方面，开发利用多模式策略的协同抗菌策略可以产生更有效的抗菌效果。在各种协同策略中，PTT和CDT的组合已被广泛研究。尽管基于纳米材料的PTT-CDT策略具有很高的有效性，但在正常情况下，PTT和CDT效应产生的热量和ROS也会对周围的正常组织和细胞造成损伤。因此，对特定细菌物种的选择性靶向是十分重要的。已知抗体可特异性识别细菌细胞并与细菌细胞紧密结合。抗体结合的抗菌纳米材料不仅减少了对正常组织和细胞的损伤，抗体与细胞表面基序的结合还缩短了抗菌材料与细菌之间的距离，从而增强了抗菌效果，因而利用抗体修饰纳米复合材料开发精确的PTT-CDT协同抗菌平台具有广阔的前景。

　　已知大多数纳米颗粒易于聚集，这可能会削弱或失去其所需的胶体性质。另一方面，良好分散的纳米颗粒在用作传感探针时具有有限的信号强度，因此灵敏度有限。金属有机框架(MOFs)是一类具有多孔结构的材料。MOFs由于其高比表面积和较大的负载能力，已被广泛用作各种物质(如酶、抗菌药物等)的支撑基质。通过物理吸附或共沉淀将纳米颗粒装载到MOFs中有望避免不必要的聚集，同时有助于浓缩纳米颗粒。当抗体配体与nanoparticle@MOF结合形成Ab-nanoparticle@MOF探针，将导致LFIA试条上的信号强度增强，从而提高细菌检测的灵敏度和靶向细菌的能力。

　　在本工作中，通过还原合成了Au/Ir双金属纳米颗粒(Au/Ir NPs)，然后通过共沉淀将其负载到Cu/Zn-MOF中以获得Au/Ir@Cu/Zn-MOF复合材料。接下来，将复合物与抗-S. aureus抗体(Ab)偶联。利用静电相互作用制备了Ab-Au/Ir@Cu/Zn-MOF探针，并建立LFIA传感器，用于检测S. aureus和精确的光热-化学动力学(PTT-CDT)协同抗菌处理(Fig. 1)。以MOF的对应物Au/Ir NPs为参考，来证明Cu/Zn-MOF富集Au/Ir NPs的重要性，从而将用于S. aureus检测的Au/Ir@Cu/Zn-MOF-LIFA的灵敏度提高了100倍，其灵敏度是传统Au NPs-LIFA的1000倍。此外，测试了Ab-Au/Ir@Cu/Zn-MOF探针对S. aureus的精确PTT-CDT协同杀菌作用，显示出优异的性能。进行了详细的实验来证实该探针具有优异的光热转换能力和ROS产生能力，以及良好的基于抗体的细菌靶向能力。总体而言，本研究开发的Ab-Au/Ir@Cu/Zn-MOF探针是一种双功能纳米复合材料，适用于S. aureus的快速检测和高效杀菌。

　　Fig. 1(a)Ab-Au/Ir@Cu/Zn-MOF探针的合成示意图，(b)基于Ab-Au/Ir@Cu/Zn-MOF探针的细菌侧流免疫测定，以及(c)Ab-Au/Ir@Cu/ZnMOF探针的抗菌应用和抗菌机制(Ab靶向/光热疗法(PTT)/化学动力学疗法(CDT))。

【研究内容】

1.基于Ab-Au/Ir@Cu/Zn-MOF探针制备的LFIA传感器

　　为实现特异性侧流免疫测定和对细菌的精确抗菌，通过静电相互作用将抗-S. aureusIgG(Ab)与Au/Ir@Cu/Zn-MOF复合材料结合。通过Zeta电位证实了Ab-Au/Ir@Cu/Zn-MOF探针的成功制备，详细讨论在“支持信息”中进行了描述。此外，每个Au/Ir@Cu/Zn-MOF纳米复合材料的共轭Abs的数量通过使用Bradford测定法，测量结合前后抗-S. aureusIgG溶液的浓度变化来测定。利用这种Ab-Au/Ir@Cu/Zn-MOF探针，设计了竞争性横向流动测试(Fig. 1b)，其中测试线(T线)涂有S. aureus，对照线(C线)用山羊抗兔IgG包被。当样品不含S. aureus时，在偶联物垫中喷洒的Ab-Au/Ir@Cu/Zn-MOF探针可以与T线(通过抗体和S. aureus相互作用)和C线(通过兔IgG和抗兔IgG相互作用)结合，从而导致T线和C线显色。相反，当样品含有S. aureus时，Ab-Au/Ir@Cu/Zn-MOF探针优先与样品中的S. aureus结合，使金黄色葡萄菌在T线上捕获的数量减少，表现为T线减轻。此类样品S. aureus/Ab-Au/Ir@Cu/Zn-MOF探针复合物不会影响C线强度，因为C线捕获了所有已结合或未结合S. aureus的Ab-Au/Ir@Cu/Zn-MOF探针。因此，可以根据T线的颜色变化直观快速地检测样品中S. aureus的浓度。

2.使用构建的LFIA条带检测S. aureus

通过制备参数的优化，制备了用于S. aureus检测的LFIA条带。如Fig. 2a所示，随着样品中S. aureus浓度的增加，T线的颜色逐渐变浅。当S. aureus的浓度增加到103CFU/mL时，它明显比空白组颜色更浅，表明其vLOD为103 CFU/mL。其qLOD经计算为3.39×102CFU/mL，T线的颜色强度与S. aureus浓度的对数在101-105CFU/mL范围内线性相关，R2为0.983(Fig. 2b)。为了证实Cu/Zn-MOF在增强探针强度和LFIA灵敏度方面的作用，构建了基于Au/Ir的LIFA条带进行比较。从Fig. 2c和Fig. 2d可以发现，基于Au/Ir的LIFA条带的vLOD和qLOD分别为105CFU/mL和3.66×104CFU/mL，比Au/Ir@Cu/Zn-MOF-LIFA传感器的灵敏度低近100倍。较高的灵敏度可归因于Cu/Zn-MOF在Au/Ir NPs富集中的作用，导致条带上较高的颜色强度。其次，Au/Ir@Cu/Zn-MOF的Zeta电位比Au/Ir更低，以及明显更大的尺寸(Fig. S1a)都导致Au/Ir@Cu/Zn-MOF探针中有更多的抗体涂层，这有助于进一步增强其灵敏度。这可以从Fig. S4c中得到初步验证，Ab贡献的Ab-Au/Ir@Cu/Zn-MOF探针的Zeta电位(14.75 mV)显著高于Ab-Au/Ir探针(3.66 mV)。此外，通过Ab浓度变化测量(Bradford测定法)每个Au/Ir NPs缀合的Abs数量为147±27，显著低于每个Au/Ir@Cu/Zn-MOF纳米复合材料缀合的数量(566±31)，也进一步证实了上述结果。

　　此外，为了评估储存稳定性，我们测试了Au/Ir@Cu/Zn-MOF-LFIA传感器在4 ℃的vLOD，获得的vLOD同样为103CFU/mL(Fig. S7a)，表明本工作中制备的LFIA传感器具有可接受的储存稳定性。除了灵敏度和储存稳定性检测外，还评估了Au/Ir@Cu/Zn-MOF-LIFA传感器用于S. aureus检测的特异性。从Fig. S7b可以看出，只有S. aureus(107CFU/mL)和混合组能够使T线的颜色从条带上消失，而单独的其他6种干扰细菌则不能，甚至它们的浓度都是S. aureus的100倍，可满足对目标S. aureus进行特异性鉴定的基本要求。

　　Fig. 2 LFIA传感器用于检测S. aureus。(a)基于Ab-Au/Ir@Cu/Zn-MOF-LFIA传感器检测磷酸盐缓冲液(PBS)中的S. aureus的结果，(b)使用Ab-Au/Ir@Cu/Zn-MOF- LFIA传感器检测S. aureus的定量结果和校准曲线，(c)基于Ab-Au/Ir-LFIA传感器在PBS中检测S. aureus的结果，(d)使用基于Ab-Au/Ir-LFIA的S. aureus检测的定量结果。(b)和(d)中的误差条表示3次测定的标准偏差。

3.在真实样品中检测S. aureus

　　为了探索所建立的Au/Ir@Cu/Zn MOF-LIFA传感器在实际样品分析中的可行性，将S. aureus添加到不同领域的真实样品中，包括食品样品(维他奶和橙汁)和水环境样品(珠江水)。如Fig. 3所示，随着S. aureus浓度的增加，T线上的信号强度逐渐减弱，这表明LIFA传感器在实际样品检测中仍然对S. aureus反应灵敏。

　　它们的vLOD均为103CFU/mL，与PBS系统中的相同。该vLOD可达到食品中S. aureus的最高安全限值(103CFU/mL)(GB 29921-2021)。此外，该LIFA传感器在实际样品中检测S. aureus的准确性也通过回收试验进行了评估。结果显示(Table S3)，加标S. aureus的平均回收率在89.87%-105.84%之间，相对标准偏差(RSD)值不超过5.68%。这样的准确度水平，使得该LFIA传感器在实际样品中显示出良好的现场检测金黄色葡萄菌的潜力。

　　Fig. 3 Ab-Au/Ir@Cu/Zn-MOF-LFIA传感器检测实际样品中的S. aureus。(a)维他奶、(b)橙汁和(c)珠江水。

4. Ab-Au/Ir@Cu/Zn-MOF探针的体外协同抗菌作用及储存稳定性

　　鉴于本工作中获得的Ab-Au/Ir@Cu/Zn-MOF探针不仅具有优异的光热性能并且凭借其多酶模拟活性具有ROS产生能力，而且还通过偶联抗-S. aureusIgG，具有精确的光热-化学动力学(PTT-CDT)协同抗菌治疗的潜力。于是，研究了Ab-Au/Ir@Cu/Zn-MOF探针对S. aureus的体外功效。

　　从Fig.4和Fig. S14a可以发现，在没有808 nm近红外光照射和H2O2的情况下，纯Ab-Au/Ir@Cu/Zn-MOF探针即使在200 μg/mL的高浓度下，也只能杀死约39.84%的细菌。然而，当向系统中加入0.4 mM H2O2时(该浓度接近细菌感染伤口中测得的量，即0.1-0.25 mM，远低于伤口消毒常用的量，如100-1000 mM)，或用808 nm近红外光照射5 min，Ab-Au/Ir@Cu/Zn-MOF探针在浓度分别为100 μg/mL和50 μg/mL时可完全灭活细菌。更令人惊讶的是，Ab-Au/Ir@Cu/Zn-MOF探针在低至6.25 μg/mL的浓度下，经H2O2和808 nm近红外光共同处理，可达到100%的杀菌效果。杀菌效果分别是单独用H2O2或808 nm近红外光处理的杀菌效果的16倍和8倍。这要归功于Au/Ir@Cu/Zn-MOF复合材料优异的光热性能和多酶模拟活性。此外，还可以发现无Ab偶联的Au/Ir@Cu/Zn-MOF复合材料在H2O2和808 nm近红外光共处理下的完全杀菌浓度为25 μg/mL，比Ab-Au/Ir@Cu/Zn-MOF探针高4倍。这是由于Ab对Ab-Au/Ir@Cu/Zn-MOF探针的细菌靶向作用，可以使得Au/Ir@Cu/Zn-MOF复合物更接近细菌，使产生的ROS和局部高温能更有效地杀灭细菌。一般来说，Ab-Au/Ir@Cu/Zn-MOF探针通过其Ab靶向能力、多酶模拟活性和光热性能，可以实现精确的协同高效抗菌效果。此外，从Fig. S14b中可以发现，6.25 μg/mL Ab-Au/Ir@Cu/Zn-MOF探针在4 ℃长达14天，这表明本工作中制备的Ab-Au/Ir@Cu/Zn-MOF探针具有可接受的储存稳定性。

　　Fig. 4S. aureus(ATCC 6538)与不同浓度的Ab-Au/Ir@Cu/Zn-MOF探针或Au/Ir@Cu/Zn-MOF复合材料在存在或不存在0.4 mM H2O2和/或808 nm激光照射(1 W/cm2)的情况下于37 ℃中共同孵育24 h后的菌落照片。

【结论】

　　本研究成功制备了由双金属NPs(Au/Ir)和Cu/Zn-MOF组成的双功能金属纳米复合材料，用于S. aureus的快速灵敏侧流免疫分析(LFIA)和体外精确光热-化学动力学协同抗菌治疗。由于Cu/Zn-MOF富集Au/Ir NPs，开发的Au/Ir@Cu/Zn-MOF-LFIA传感器能够实现对S. aureus的高灵敏度检测，视觉检测限为103CFU/mL，比基于Au/Ir的LIFA传感器低100倍。此外，该传感器在实际样品中检测S. aureus时也表现出足够的特异性、可行性和准确性。得益于优异的光热性能和多酶模拟活性(过氧化物酶-过氧化氢酶-氧化酶模拟活性)，以及抗体的细菌靶向作用，Ab-Au/Ir@Cu/Zn-MOF探针可以在体外实现精确的光热-化学动力学协同抗菌效果。在H2O2和808 nm近红外激光的共同作用下，纳米复合材料在6.25 μg/mL的低浓度下完全灭活细菌。

　　然而，值得注意的是，当应用于治疗细菌感染时，这种Ab缀合的Au/Ir@Cu/Zn-MOF探针(通过物理吸收制备)可能受到细菌环境中复杂生物介质的影响，导致Ab从Au/Ir@Cu/Zn-MOF上脱落，从而失去其细菌靶向功能。为此，设想将探针结合到多孔水凝胶中(制作水凝胶敷料或软膏等)，不仅可以预防Ab-Au/Ir@Cu/Zn-MOF在复杂的生物介质中不会散开，还能去除用过的Ab-Au/Ir@Cu/Zn-MOF和死细菌细胞，降低纳米材料对生物体的潜在毒性和炎症的发生率。

【原文出处】

　　Zhong, Y., Zheng, X. T., Li, Q. L., Loh, X. J., Su, X., & Zhao, S. (2023). Antibody conjugated Au/Ir@Cu/Zn-MOF probe for bacterial lateral flow immunoassay and precise synergistic antibacterial treatment.Biosensors & bioelectronics,224, 115033.