猪瘟病毒强弱毒鉴别诊断ELISA操作方法

（一）试验材料

          1．猪瘟弱毒单抗纯化酶联抗原和猪瘟强毒单抗纯化酶联抗原，分别供检测经猪瘟弱毒疫苗免疫后产生的抗体和感染猪瘟强毒后产生的抗体之用。

2．酶标抗体

3．猪瘟阳性、阴性血清

4．酶联板及其他必要的试剂。

（二）操作步骤

    1．用包被液将猪瘟弱毒单抗纯化酶联抗原、猪瘟强毒单抗纯化酶联抗原各作100倍稀释，以100微升分别加入做好标记的酶联板孔中，置湿盒于4℃过夜。

2．弃去孔内液体。用洗涤液冲洗酶联板3次，每次间隔3~5分钟，拍干。

3．用稀释液将待检血清作400倍稀释，每孔加100微升。同时，将猪瘟阳性、阴性血清以100稀释作对照，37℃培育1.5~2小时。

4．重复第2步。

5．用稀释液将兔抗猪IgG—辣根过氧化物酶结合物作100倍稀释，每孔加入100微升，37℃培育1.5~2小时。

6．重复第2步。

    7．每孔加入底物溶液（每块板所需的底物溶液按邻苯二胺5毫克+底物缓冲液5毫升+30%过氧化氢18.75微升配制）100微升，室温下观察显色反应（一般阴性对照孔略微显色，立即终止反应，并以阴性孔作空白调零）。

8．每孔加入终止液50微升，于酶联读数仪上测定490nm波长的光密度（OD）。

（三）判定标准

在猪瘟弱毒酶联板上：OD>0.2为猪瘟弱毒抗体阳性

                    OD<0.2为猪瘟弱毒抗体阴性

在猪瘟强毒酶联板上：OD≥0.5为猪瘟强毒抗体阳性

                    OD<0.5为猪瘟强毒抗体阴性

（四）注意事项

     1．运输单抗纯化酶联抗原时，必须使用冰盒低温运输；猪瘟强弱毒单抗纯化酶联抗原在4℃保存6个月，在—18℃保存12个月。

     2．配制洗涤液时，应使用新鲜蒸馏水或无离子水，每次洗板后，尽量不使孔中有残余液体，以免影响结果。

     3．底物溶液应临用前配制，待邻苯二胺完全溶解于底物缓冲液后再加过氧化氢，混匀后立即加入孔中。

      终止反应后，应立即读数。